一种广谱中和活性新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种广谱中和活性新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用，属于免疫学与生物技术领域。本发明专利技术制备筛选得到了一种具有广谱中和活性单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还公开了广谱性中和活性单克隆抗体在鉴定高度保守性中和抗原表位以及制备基因工程治疗性抗体等方面的应用。的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
NO.3所示。
[0011]本专利技术提供一种表达上述的单克隆抗体的重组载体，所述重组载体含有上述的基因序列。
[0012]进一步地限定，所述重组载体的出发载体为pCAGneo载体。
[0013]本专利技术提供一种表达上述的单克隆抗体的重组微生物细胞，所述重组微生物细胞表达上述的重组载体。
[0014]进一步地限定，所述重组微生物细胞为真核微生物细胞或者原核微生物细胞。
[0015]本专利技术提供上述的单克隆抗体、上述得重组载体或上述的重组微生物细胞在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术提供上述的单克隆抗体、上述得重组载体或上述的重组微生物细胞在制备治疗或诊断新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
[0017]有益效果：本专利技术利用细胞系表达的RBD蛋白为抗原免疫小鼠，经过筛选得到了一株具有广谱性中和活性的S蛋白(RBD结构域)单克隆抗体。对广谱性单克隆抗体进行了基因测序，获得了抗体重链和轻链可变区氨基酸序列。单克隆抗体用ELISA方法进行效价测定，培养细胞上清中单抗效价为1：1280，小鼠腹水中单克隆抗体效价为1：204800。单克隆抗体与O
‑
RBD结合的亲和力常数为kD＝1.17
×
10
‑7Mol。
附图说明
[0018]图1为表达与纯化新型冠状病毒(SARS
‑
COV
‑
2)RBD蛋白的电泳分析；
[0019]图2为单克隆抗体与三种变异株新型冠状病毒RBD蛋白western blot反应结果。E2为猪瘟E2蛋白，作为阴性对照；
[0020]图3为单克隆抗体22.9
‑
1与细胞中RBD蛋白的间接免疫荧光反应结果；
[0021]图4为单克隆抗体22.9
‑
1病毒中和试验结果。
具体实施方式
[0022]实施例1：新型冠状病毒RBD蛋白的表达与纯化
[0023]参考SARS
‑
COV
‑
2Omicron变异株S基因序列(GISAID数据库基因序列号：EPI_ISL_7160037，GISAID数据库网址：https://gisaid.org/)。将编码RBD区域的基因序列进行密码子优化，在5
’
端加入信号肽基因序列(atgaagttctcctgggtgatgttcttcctgatggccgtggtgaccggcgtgaactcc)，在3
’
端加入两个6
×
His标签编码序列，组合成表达框，优化后的表达框基因序列如SEQ ID NO.3所示，密码子优化基因序列命名为opti
‑
O
‑
RBD。opti
‑
O
‑
RBD基因由生物公司进行合成后克隆到真核表达载体pCAGneo((Hua et al.,2014.Generation and characterization of a new mammalian cell line continuously expressing virus
‑
like particles of Japanese encephalitis virus for a subunit vaccine candidate.DOI:10.1186/1472
‑
6750
‑
14
‑
62))的SacI与BglII酶切位点之间，构建了重组表达质粒pCAG
‑
opti
‑
O
‑
RBD。将重组质粒pCAG
‑
opti
‑
O
‑
RBD转染BHK
‑
21细胞，转染细胞用含G418培养基进行选择培养后获得稳定表达细胞株B
‑
ORBD。将稳定表达细胞株进行扩大培养后收获细胞培养上清液，细胞表达止清液用Ni
‑
NTA树脂进行亲和层析纯化，纯化的O
‑
RBD蛋白用SDS
‑
PAGE进行电泳分析表明得到了纯化的S蛋白(图1)。
[0024]实施例2：单克隆抗体的制备与鉴定
[0025]利用实施例1获得的表达纯化的重组蛋白O
‑
RBD作为免疫原，免疫6周龄BALB/c小鼠，采用常规脾脏淋巴细胞杂交瘤技术进行融合，经有限稀释法克隆后获得1株分泌特异性针对SARS
‑
COV
‑
2 RBD蛋白的杂交瘤细胞，命名为22.9
‑
1。该单克隆抗体经亚型鉴定试剂盒鉴定为IgG1/κ型。单克隆抗体用ELISA方法进行效价测定，培养细胞上清中单抗效价为1：1280，小鼠腹水中单克隆抗体效价为1：204800。单克隆抗体与O
‑
RBD结合的亲和力常数为kD＝1.17
×
10
‑7Mol。该单克隆抗体用ELISA试验表明单克隆抗体能同时与野生型RBD蛋白(WT
‑
RBD)，Delta变异株RBD蛋白(D
‑
RBD)，以及Omicron变异株(O
‑
RBD)时发生反应，结果如表1所示。
[0026]WT
‑
RBD与D
‑
RBD均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病实验室制备提供，WT
‑
RBD(GenBank accession No.NC_045512)与D
‑
RBD(GISAID,EPI_ISL_2863933)蛋白的表达与纯化方法与实施例一相同。经western blot检测表明均可特异地与SARS
‑
COV
‑
2不同变异株RBD蛋白反应，试验结果见图2。间接免疫荧光试验亦表明该单克隆抗体均能够识别细胞表达的SARS
‑
COV
‑
2 RBD蛋白，结果见图3。
[0027]单克隆抗体病毒中和活性鉴定：采用表达新型冠状病毒S蛋白的VSVΔG
‑
GFP的嵌合病毒进行抗体中和试验检测。四种分别表达野生型(WT)、Delta(D)、BA.1与BA.2变异株S蛋白的嵌合病毒均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病团队制备、鉴定和提供，制备方法按文献方法进行(Shan,D.et al.Immunogenicity of a recombinant VSV
‑
Vectored SARS
‑
CoV vaccine induced robust immunity in rhesus monkeys after single
‑
dose immunization.Virol.Sin.37,248
–
255(2022).)。
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种广谱中和活性新型冠状病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区CDR
‑
H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示48
‑
54位的氨基酸序列，CDR
‑
H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示69
‑
84位氨基酸序列；CDR
‑
H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第117
‑
130位氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区CDR
‑
L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示44
‑
60位的氨基酸序列，CDR
‑
H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示76
‑
82位氨基酸序列；CDR
‑
H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的第115
‑
122位氨基酸序列。2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.编码权利要求1所述的单克隆抗体的基因序列，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区CDR
‑
H...

【专利技术属性】
技术研发人员：华荣虹，步志高，葛金英，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：