表达重链抗体的转基因动物制造技术

本公开内容一般性涉及用于表达重链抗体(HCAb)的在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因动物以及用于生成该转基因动物的核酸构建体、细胞及方法。本公开内容还涉及包含衍生自由转基因动物产生的重链抗体的序列的结合剂。体的序列的结合剂。体的序列的结合剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达重链抗体的转基因动物


[0001]本公开内容一般性涉及用于表达重链抗体(HCAb)的在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因动物以及用于生成转基因动物的核酸构建体、细胞及方法。本公开内容还涉及包含衍生自由转基因动物产生的重链抗体的序列的结合剂。
[0002]背景
[0003]驼类(camelid)及软骨鱼天然产生由功能性同二聚重链抗体(HCAb)构成的抗体(Hamers
‑
Casterman等人,1993；Muyldermans及Smider,2016)。HCAb的重链缺乏第一恒定域(CH1)且与经典抗体的不同之处仅在于轻链配对通常涉及的一些氨基酸取代(Muyldermans等人,1994；Vu等人,1997)。这些取代(Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg及Trp47Gly)存在于框架区2(FR2)中。HCAb的抗原结合片段称作单域抗体(sdAb)、VHH或sdAb具有约15kDa的分子量，使得其适于需要增强的组织渗透或快速清除的应用，诸如基于放射性同位素的成像。
[0004]驼类HCAb的可变区与相应经典CDR相比具有较长CDRH1及CDRH3环，从而增加互补位尺寸。较长CDR结合表位，其比经典抗体的表位更隐蔽。它们还可通过在催化位点中进入裂缝来抑制酶(Sircar等人，The Journal of Immunology,186,2011)。
[0005]单域抗体目前被以各种抗体样形式(包括多特异性及多价形式)探索用作治疗剂及诊断剂。<br/>[0006]由于预期含有驼类序列的抗体会诱导人类中的免疫反应，因此最近的工作主要集中于在转基因小鼠中研发人类单域抗体。这些小鼠模型是通过使小鼠IgH基因座的部分失活或对其进行置换以编码人类可变(V)区段、多样性(D)区段及连接(J)区段来设计(参见WO2016/062990A1、US2011/0145937A1)。
[0007]尽管单域抗体可通过驼类的免疫接种获得，但此方法耗时且昂贵。此外，需要大量免疫原，且所获得的抗体库(repertoire)受到限制。
[0008]表达包含驼类VHH、驼类/人类杂交VH或人类VH的单域抗体的转基因小鼠是通过将重排或未经重排的微型基因座随机整合至缺失IgM的小鼠的基因组中而生成(Zhou等人，J.Immunol.,175(6):3369
‑
79(2005)；Janssens等人，PNAS 103(41):15130
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15135(2006)；Drabek等人，Front.Immunol.7:619(2016),美国专利第8,502,014号)。这些模型遭受以下限制：具有低表达且使得由免疫接种产生的HCAb池中的多样性不佳。
[0009]概述
[0010]申请人尤其在本文中提供用于产生驼类单域抗体的转基因非人类动物，其在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰。
[0011]本文提供经基因修饰的动物，以促进驼类单域抗体的产生。
[0012]在本公开内容的一些方面中，转基因动物用于表达各种同种型及不同遗传背景的HCAb。
[0013]在本公开内容的其他方面中，提供用于增加所产生的HCAb库中的多样性的转基因动物。
[0014]分析在免疫接种本文所公开的转基因动物后生成的仅抗原特异性抗体(HCAb)池且选择HCAb候选物。
[0015]在一些实施方案中，HCAb用于制造结合剂。
[0016]在一些实施方案中，HCAb用于制造治疗剂。
[0017]在一些实施方案中，HCAb用于制造诊断剂。
[0018]在一些方面及实施方案中，本公开内容涉及一种在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因非人类动物。
[0019]在一些实施方案中，所有修饰均在同一等位基因上。在其他实施方案中，两个等位基因可相同。然而，在其他实施方案中，两个等位基因可不同。
[0020]在一些实施方案中，本公开内容的转基因非人类动物包含例如选自由以下组成的组的生殖系修饰：
[0021]a.内源性非人类动物γ球蛋白基因的CH1域的缺失，或；
[0022]b.至少一个内源性非人类动物γ球蛋白的CH1域的缺失与至少一个其他内源性非人类动物γ球蛋白基因的完全或部分缺失的组合。
[0023]在其他实施方案中，本公开内容的转基因非人类动物包含选自例如以下组成的组的生殖系修饰：
[0024]a.内源性非人类动物γ球蛋白基因的CH1域的修饰，或；
[0025]b.至少一个内源性非人类动物γ球蛋白的CH1域的修饰与至少一个其他内源性非人类动物γ球蛋白基因的完全或部分缺失的组合。
[0026]在一些实施方案中，CH1域的修饰产生非功能性CH1域。在一些实施方案中，非功能性CH1域修饰无法与轻链配对。
[0027]在一些实施方案中，本公开内容的转基因非人类动物为包含选自例如由以下组成的组的生殖系修饰的小鼠：
[0028]a.内源性小鼠γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的CH1域的缺失，或；
[0029]b.至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性小鼠基因的CH1域的缺失与至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性小鼠基因的完全或部分缺失的组合。
[0030]在其他实施方案中，本公开内容的转基因非人类动物为包含选自例如由以下组成的组的生殖系修饰的小鼠：
[0031]a.内源性小鼠γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的CH1域的修饰，或；
[0032]b.至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性小鼠基因的CH1域的修饰与至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性小鼠基因的完全或部分缺失的组合。
[0033]在示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ3基因的CH1域的缺失。
[0034]在示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ1基因的CH1域的缺失。
[0035]在另一示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ2b基因的CH1域的缺失。
[0036]在另一示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ2a基因的CH1域的缺失。
[0037]在另一示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ3基因、γ1基因、γ2b基因及γ2a基因的CH1域的缺失。
[0038]在另一示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ2a基因的CH1域的缺失及内源性γ2b基因的缺失。
[0039]在另一示例性实施方案中，生殖系修饰包含内源性γ3基因及γ2a基因的CH1域的缺失及γ2b基因的缺失。
[0040]在一些实施方案中，转基因非人类动物为包含内源性小鼠V、D及J区段及至少一个缺乏功能性CH1域的内源性小鼠IgG恒定区基因的转基因小鼠。
[0041本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含：a)未经重排的重链可变(V)、多样性(D)及连接(J)基因区段，且其中D和/或J基因区段包含驼类D和/或J基因区段；及b)至少一个缺乏功能性CH1域的IgG恒定区基因。2.如权利要求1的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物能够表达仅重链抗体(HCAb)或编码该抗体的核酸。3.如权利要求1或2的转基因非人类动物，其中该修饰包含a)将一个或多个内源性非人类D和/或J基因区段置换为一个或多个未经重排的驼类D和/或J基因区段，及b)至少一个IgG恒定区基因的CH1域的部分或完全缺失。4.如权利要求1或2的转基因非人类动物，其中该修饰包含a)插入一个或多个未经重排的驼类D和/或J基因区段，及b)至少一个IgG恒定区基因的CH1域的部分或完全缺失。5.如权利要求1或2的转基因非人类动物，其中该修饰包含a)将一个或多个内源性非人类D和/或J基因区段置换为一个或多个未经重排的驼类D和/或J基因区段或插入一个或多个未经重排的驼类D和/或J基因区段，及b)修饰至少一个IgG恒定区基因的CH1域。6.如权利要求1至5中任一项的转基因非人类动物，其中该修饰包含用未经重排的驼类D及J基因区段置换所有内源性非人类D及J区段。7.如权利要求1至6中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自单一驼类物种。8.如权利要求1至6中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自至少两个、至少三个或至少四个驼类物种。9.如权利要求1至8中任一项的转基因非人类动物，其中该修饰进一步包含用多个哺乳动物物种的V基因区段置换一个或多个内源性非人类V基因区段或插入多个哺乳动物物种的V基因区段。10.如权利要求1至8中任一项的转基因非人类动物，其中该修饰进一步包含用一个或多个驼类V基因区段置换一个或多个内源性非人类V基因区或插入驼类V基因区段。11.如权利要求10的转基因非人类动物，其中该修饰包含将所有内源性非人类V区段置换为驼类V基因区段。12.如权利要求1至11中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段来自至少两个物种。13.如权利要求1至11中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段来自至少三个物种。14.如权利要求1至11中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段来自至少四个物种。15.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段编码VH或VHH多肽。16.如权利要求15的转基因非人类动物，其中该VH或VHH多肽为驼类VH或驼类VHH多肽。17.如权利要求16的转基因非人类动物，其中该驼类VH多肽来自羊驼、美洲驼、双峰驼、小羊驼或单峰驼。18.如权利要求16的转基因非人类动物，其中该驼类VHH多肽来自羊驼、美洲驼、双峰
驼、小羊驼或单峰驼。19.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含来自羊驼的V区段、来自双峰驼的V区段、来自美洲驼的V区段、来自小羊驼的V区段和/或来自单峰驼的V区段。20.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自羊驼。21.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自双峰驼。22.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自美洲驼。23.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自单峰驼。24.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该驼类D和/或J基因区段来自小羊驼。25.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含一个至至少七个羊驼D基因区段。26.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含一个至至少七个羊驼J基因区段。27.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含一个至至少七个双峰驼D基因区段。28.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含一个至至少七个双峰驼J基因区段。29.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含一个至至少六个羊驼V基因区段。30.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含一个至至少十个双峰驼V基因区段。31.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含一个至至少十个美洲驼V基因区段。32.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含一个至至少六个单峰驼V基因区段。33.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含一个至至少六个小羊驼V基因区段。34.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段、D基因区段和/或J基因区段编码天然存在的序列。35.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段、D基因区段和/或J基因区段编码突变序列。36.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgG恒定区基因为内源性非人类IgG恒定区基因或其部分。37.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgG恒定区基因为γ3恒定
区基因、γ1恒定区基因、γ2b恒定区基因或γ2a恒定区基因。38.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中至少两个IgG恒定区基因包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。39.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中至少三个IgG恒定区域基因包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。40.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中所有IgG恒定区域基因包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。41.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中至少一个IgG恒定区基因包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失，且至少一个其他IgG恒定区基因完全或部分缺失。42.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含γ3恒定区基因，其包含在一个或两个等位基因处的编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。43.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含γ1恒定区基因，其包含在一个或两个等位基因处的编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。44.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含γ2b恒定区基因，其包含在一个或两个等位基因处的编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。45.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该IgH基因座包含γ2a恒定区基因，其包含在一个或两个等位基因处的编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。46.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的至少一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含选自由以下组成的组的IgG恒定区基因：γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；γ1恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；γ2b恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；或其组合。47.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失；及γ1及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。48.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ2b恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。49.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。50.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。51.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区
域中的部分或完全缺失；γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失。52.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的一个等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2b恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。53.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的另一等位基因包含相同的IgH基因座或相同的IgG恒定区基因。54.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的另一等位基因包含野生型IgH基因座或野生型IgG恒定区基因。55.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的另一等位基因包含IgH基因座，其包含选自以下的修饰：编码至少一个或所有IgG恒定区基因的CH1域的区域中的部分或完全缺失、至少一个或所有其他IgG恒定区基因的完全或部分缺失或其组合。56.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，其包含野生型非人类γ3、γ1、γ2b及γ2a恒定区基因。57.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座含：γ3、γ1及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失；及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。58.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座含：γ3及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失。59.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ3恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。60.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，其包含γ3、γ1及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失。61.如权利要求46至52中任一项的转基因非人类动物，其中另一等位基因包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失。62.如权利要求1至37中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的两个等位基因均包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ2b恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。63.如权利要求1至37中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的两个等位基因均包含IgH基因座，该IgH基因座包含：γ3及γ2a恒定区基因，其包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失；及γ2b恒定区基因的部分或完全缺失。64.如权利要求1至37中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的两个等位基因均包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ3、γ1、γ2b及γ2a恒定区基因，该恒定区基因包含在编码CH1域的区域中的部分或完全缺失。65.如权利要求1至37中任一项的转基因非人类动物，其中转基因非人类动物基因组的
两个等位基因均包含IgH基因座，该IgH基因座包含γ3、γ1、γ2b及γ2a恒定区基因，该恒定区基因包含在编码CH1域的区域中的完全缺失。66.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中非人类动物基因组在每个等位基因上包含至少一个不同的V基因区段。67.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中非人类动物基因组在其一个等位基因中包含一个物种的至少一个V基因区段并在另一等位基因中包含另一物种的至少一个V基因区段。68.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物进一步包含IgM恒定区基因的生殖系修饰，其中该修饰包含将IgM CH1域置换为驼类CH1域。69.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该非人类动物包含美洲驼、双峰驼和/或羊驼物种的至少约10kb、至少约20kb、至少约30kb、至少约40kb或至少约50kb的驼类V基因区段。70.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该V基因区段、D基因区段及J基因区段能够进行VDJ重排。71.一种在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因非人类动物，其中该修饰选自由以下组成的组：a.内源性非人类动物γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的CH1域的缺失，或；b.至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性非人类动物基因的CH1域的缺失与至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性非人类动物基因的完全或部分缺失的组合。72.一种在免疫球蛋白重链(IgH)基因座处包含生殖系修饰的转基因非人类动物，其中该修饰选自由以下组成的组：a.内源性非人类动物γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的CH1域的修饰，或b.至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性非人类动物基因的CH1域的修饰与至少一个选自γ3基因、γ1基因、γ2b基因和/或γ2a基因的内源性非人类动物基因的完全或部分缺失的组合。73.如权利要求71或72的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物包含选自小鼠V、D和/或J、驼类V、D和/或J、或人类V、D和/或J或其组合的V、D和/或J区段。74.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为杂合的。75.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为纯合的。76.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为转基因大鼠。77.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为转基因小鼠。78.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该非人类动物为包含编码缺乏CH1域的小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b或小鼠IgG3恒定区的IgG恒定区基因的转基因小鼠。
79.如权利要求78的转基因非人类动物，其中至少两个选自小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b或小鼠IgG3恒定区的IgG恒定区基因缺乏CH1域。80.如权利要求78的转基因非人类动物，其中至少三个选自小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b或小鼠IgG3恒定区的IgG恒定区基因缺乏CH1域。81.如权利要求78的转基因非人类动物，其中小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b及小鼠IgG3恒定区中的每一种缺乏CH1域。82.如权利要求78至81中任一项的转基因非人类动物，其中小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b或小鼠IgG3中的至少一者部分或完全缺失。83.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为转基因小鼠，且其中所有内源性小鼠D及J基因区段经未经重排的驼类D及J基因区段置换。84.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为转基因小鼠，且其中该转基因小鼠的该IgH基因座包含一个或多个小鼠V基因区段及未经重排的驼类V基因区段。85.如前述权利要求中任一项的转基因非人类动物，其中该转基因非人类动物为转基因小鼠，且其中所有内源性小鼠V基因区段经未经重排的驼类V基因区段...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯文洋，李鑫，L，
申请(专利权)人：加拿大商木曾路生物科技公司，
类型：发明
国别省市：