多肽、蛋白质复合物及其制造方法技术

本发明专利技术大体上系关于多肽，该等多肽包含一或多个抗原结合域及允许将至少两个多肽链组装成多价和/或多特异性蛋白质复合物的二聚域。本发明专利技术之该等多肽及蛋白质复合物具有抗肿瘤活性。瘤活性。瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多肽、蛋白质复合物及其制造方法


[0001]本专利技术大体上系关于多肽，该等多肽包含一或多个抗原结合域及允许将至少两个多肽链组装成多价和/或多特异性蛋白质复合物的二聚域。本专利技术之该等多肽及蛋白质复合物具有抗肿瘤活性。

技术介绍

[0002]骆驼及软骨鱼天然产生由功能性同二聚重链抗体(HCAb)构成之抗体(Hamers
‑
Casterman等人,1993；Muyldermans及Smider,2016)。HCAb之重链缺乏第一恒定域(CH1)且与经典抗体之不同之处仅在于轻链配对通常涉及之一些氨基酸取代(Muyldermans等人,1994；Vu等人,1997)。此等取代(Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg及Trp47Gly)存在于构架区2(FR2)中。HCAb之抗原结合片段称作单域抗体(sdAb)、VHH或VHH具有约15kDa之分子量，使得其适于需要增强之组织渗透或快速清除的应用，诸如基于放射性同位素之成像。然而，对于治疗性应用，通常需要增加VHH半衰期以便将肾清除率降至最低及优化治疗功效(De Vlieger等人,Antibodies8(1),1
‑
22,2019)。尽管已采用增加VHH半衰期之方法，诸如聚乙二醇化、N
‑
糖基化、HSA或其他载体蛋白融合，但此类构筑体可引入免疫原性或成功率有限。
[0003]已将VHH用作构筑嵌段来制得双特异性及多特异性抗体。在一些研究中，已显示二价构筑体具有相较于单价形式增加之亲合力或亲和力(Conrath等人,2001；Coppieters等人,2006；Hmila等人,2008；Simmons等人,2006及Hultberg等人,2011、等人(2010)、Fridy等人,2014)。
[0004]多种基于VHH之治疗剂目前正处于研究后期或已受FDA批准。此等治疗剂包括针对抗原vWF的经批准用于血栓性血小板减少性紫癫(Thrombotic thrombocytopenic purpura)的二价单特异性抗体卡普拉珠单抗(Caplacizumab)(Duggan,2018)。针对RSV之三价纳米抗体复合物ALX
‑
0171处于针对呼吸道合胞病毒感染之研发后期(Detallea等人,2015)。ALX
‑
0061为针对抗原IL
‑
6R但与HSA纳米抗体连接以延长半衰期的单价抗体，且处于针对RA及SLE适应症之临床研发阶段(Van Roy等人,2015)。研究性药物ALX
‑
0761含有针对抗原IL
‑
17A、IL
‑
17F及HAS之三种纳米抗体且正研发用于牛皮癣(Svecova等人,2019)。抗RANKL ALX
‑
0141为针对抗原RANKL之二价抗体且连接于HSA以延长半衰期(Schoen等人,2013)。奥利珠单抗(Ozoralizumab)为针对抗原TNFα之二价纳米抗体且连接于HSA以延长半衰期(Fleischmann等人,2012)。
[0005]尽管有此等研发，仍需要结合多个目标且产生有效免疫反应之抗体样分子。

技术实现思路

[0006]本申请人已产生多肽，其包含抗原结合域及允许组装两个多肽链以形成多价和/或多特异性蛋白质复合物的二聚域。
[0007]本专利技术的多肽系由不同模块构成且包括针对其结合特异性目标之能力而选择的
抗原结合域。亦可针对其活体内和/或活体外功能特性或生物效应，包括例如其调节细胞过程(诸如基因表达、信号转导、细胞生长、细胞活力及其类似者)的能力来选择抗原结合域。
[0008]抗原结合域经工程改造成单一多肽链以便用单个部分靶向不同细胞组分或不同细胞类型。多肽链可组装成蛋白质复合物，诸如二聚体，以强化其生物效应。因此可藉由投与单一多肽或蛋白质复合物物种来调节若干细胞过程。另外，同一分子内存在多个目标特异性抗原结合域可在由各抗原结合域定位之所有细胞聚集在一起时确保该等细胞最终经递送至同一位置。额外益处为以及时方式或几乎同时触发各种生物效应。
[0009]此表示优于投与分开之抗体的显著优势，因为藉由单个部分考虑影响此类投与之结果的若干参数，包括剂量、投与时程、投与途径、药效学、药物动力学，而非分开地考虑各部分。如此，投与分开之抗体未必总是达成所需生物效应。
[0010]此外，多肽链及蛋白质复合物适于与治疗剂或可侦测部分结合。
[0011]本文揭示之多肽及蛋白质复合物之另一益处在于各种抗原结合域与其目标之结合可以协同方式发生。举例而言，给定单域抗体与其目标之结合可有助于其他各者之结合。
[0012]基于本专利技术，本申请人已产生多肽及蛋白质复合物，其由靶向肿瘤和/或调节免疫检查点和/或募集免疫细胞之各种单域抗体构成。举例而言，在一些实施例中，该等多肽部分及蛋白质复合物系由靶向肿瘤之各种单域抗体构成。在一些实施例中，该等多肽部分及蛋白质复合物系由调节免疫检查点之各种单域抗体构成。在一些实施例中，该等多肽部分及蛋白质复合物系由募集免疫细胞之各种单域抗体构成。在一些实施例中，该等多肽部分及蛋白质复合物系由靶向肿瘤、调节免疫检查点及募集免疫细胞之各种单域抗体构成。
[0013]本申请人证实本专利技术之多肽链单独或与化学疗法组合促进活体内临床前模型之肿瘤消退。
[0014]另一优势在于本专利技术之多肽链有效地表达于细胞中。本文中所揭示之多肽链之型式允许达成公克/公升之范围内的蛋白质复合物产量。
[0015]本申请人亦出人意料地发现一种制备具有优于单价多肽之各种有利特性的模块化、多功能、多特异性和/或多价多肽的方法，该等有利特性包括例如细胞靶向的增加之亲合力及增加之特异性。
[0016]并入本专利技术之多肽中的VHH、单域Ab结合部分不需要用于抗原结合之轻链，相较于需要轻链之结合部分，其降低分子量、大小、复杂度及二硫键数目。此又具有各种优势，例如简化适合于抗癌疗法之量的制造。并入本专利技术之多肽中的CH2
‑
CH3域适用于标准抗体纯化制程且赋予比VHH蛋白之半衰期长的全尺寸抗体半衰期。本专利技术之多肽之各链之不同大小简化异二聚体与同二聚体之间的区别且有助于简化此等抗体之制造。另一所需特性为在本专利技术之多肽之不同位置处使用的连接子。藉由选择未特别设计以易于由蛋白酶裂解的连接子，本专利技术克服多特异性抗体被破坏成否则将缺乏多特异性益处的其组分部分。
[0017]本专利技术之多肽之另一优势为多肽之结构。此优势包括例如经由连接子及抗体优化克服当结合部分位于多肽之C端时的较低结合亲和力限制。额外优势包括例如CH2
‑
CH3域与免疫系统之各种受体接合且强加结合部分之空间组织。空间组织克服端对端线性配置之结合部分之限制，在该限制下，随着结合部分数目增加，中间之分子之特性的控制变得更加困难。
[0018]于多肽链内且甚至在将多肽链组装成二聚体蛋白质复合物后仍保留单域抗体之<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，其以N端至C端方式包含式Ib之氨基酸序列：X
‑
[(Ab
a
)
‑
(L
b
)]
m
‑
(DD)
‑
[(L
c
)
‑
(Ab
d
)]
n
‑
Y其中m为0、1或大于1之整数；其中n为2或大于2之整数；其中Ab
a
、Ab
d
各独立地包含抗原结合域，该抗原结合域包含抗体之一或多个互补决定区(complementarity determining region；CDR)；其中X或Y独立地存在或不存在且包含氨基酸序列；其中L
b
、L
c
各独立地包含一或多个连接子；其中L
c
不包含可裂解连接子；且其中DD包含二聚域。2.如权利要求1的多肽，其中该二聚域包含CH2域、CH3域或其组合。3.如权利要求1或2的多肽，其中该二聚域包含CH3域，该CH3域包含一或多个根据EU编号在对应于D399、D/E356和/或K370的位置处之突变。4.如权利要求3的多肽，其中该CH3域进一步包含一或多个根据EU编号在对应于Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394和/或P395之位置处的突变。5.如权利要求3或4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q及K370E。6.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K。7.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及L351W。8.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及S354M。9.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及T350I。10.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及T350V。11.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及P352R。12.如权利要求4的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及P352E。13.如权利要求1或2的多肽，其中该二聚域包含CH3域，该CH3域包含一或多个根据EU编号在对应于D399、E357和/或K439的位置处之突变。14.如权利要求13的多肽，其中该CH3域进一步包含一或多个根据EU编号在对应于Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394和/或P395之位置处的突变。15.如权利要求13或14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q及K439E。16.如权利要求14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D。
17.如权利要求14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及L351R。18.如权利要求14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及L351Y。19.如权利要求14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及T350I。20.如权利要求14的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及T350V。21.如权利要求2的多肽，其中该CH3域为包含选自由以下组成之群之突变的CH3域：a.突变D399N、D/E356Q、K370E；b.突变D399N、K439E、E357Q；c.突变D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K；d.突变D399N、D/E356Q、K370E及L351W；e.突变D399N、D/E356Q、K370E及S354M；f.突变D399N、D/E356Q、K370E及T350I；g.突变D399N、D/E356Q、K370E及T350V；h.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352R；i.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352E；j.突变D399Q、D/E356Q及K370E；k.突变D399N、D/E356Q、K370E及L351Y；l.突变D399N、D/E356Q、K370E及L351H；m.突变D399N、D/E356Q、K370E及R355K；n.突变D399N、D/E356Q、K370E及Q355K；o.突变D399N、D/E356Q、K370E及S354K；p.突变D399N、D/E356Q、K370E及T350L；q.突变D399N、D/E356Q、K370E及T394N；r.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352Y；s.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352V；t.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352T；u.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352L；v.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352G；w.突变D399N、D/E356Q、K370E及P352C；x.突变D399N、D/E356Q、K370E及L351T；y.突变D399N、D/E356Q、K370E及L351A；z.突变D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D；aa.突变D399N、E357Q、K439E及L351R；bb.突变D399N、E357Q、K439E及L351Y；cc.突变D399N、E357Q、K439E及T350I；dd.突变D399N、E357Q、K439E及T350V；
ee.突变D399Q、K439E、E357Q；ff.突变D399N、K439E、E357Q、S354K；gg.突变D399N、K439E、E357Q、S354W；hh.突变D399N、K439E、E357Q、Y349R；ii.突变D399N、K439E、E357Q、T350L；jj.突变D399N、K439E、E357Q、R355W；kk.突变D399N、K439E、E357Q、Q355W；ll.突变D399N、K439E、E357Q、P395I；mm.突变D399N、K439E、E357Q、P395G；nn.突变D399N、K439E、E357Q、P395E；oo.突变D399N、K439E、E357Q、P352K；pp.突变D399N、K439E、E357Q、P352D；及qq.突变D399N、K439E、E357Q、L351D。22.一种多肽，其以N端至C端方式包含式Ic之氨基酸序列：X
‑
[(Ab
a
)
‑
(L
b
)]
m
‑
(DD)
‑
[(L
c
)
‑
(Ab
d
)]
n
‑
Y其中m为0、1或大于1之整数；其中n为0、1或大于1之整数，其限制条件为m及n不同时为0；其中Ab
a
、Ab
d
各独立地包含抗原结合域，该抗原结合域包含抗体之一或多个互补决定区(CDR)；其中X或Y独立地存在或不存在且包含氨基酸序列；其中L
b
、L
c
各独立地包含一或多个连接子；其中DD包含二聚域，该二聚域包含包含一或多个根据EU编号在对应于D399、D/E356和/或K370的位置处之突变的CH3域；或包含一或多个根据EU编号在对应于D399、E357和/或K439的位置处之突变的CH3域。23.如权利要求22的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E356Q及K370E。24.如权利要求22的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q及K439E。25.如权利要求22至24中任一项的多肽，其中该CH3域进一步包含一或多个根据EU编号在对应于Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394和/或P395之位置处的突变。26.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K。27.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及L351W。28.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及S354M。29.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及T350I。30.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及T350V。
31.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及P352R。32.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、D/E356Q、K370E及P352E。33.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D。34.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及L351R。35.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及L351Y。36.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及T350I。37.如权利要求25的多肽，其中该CH3域包含根据EU编号之突变D399N、E357Q、K439E及T350V。38.如前述权利要求中任一项的多肽，其中当m为2或大于2之整数时，该等[(Ab
a
)
‑
(L
b
)]单元相同。39.如权利要求1至37中任一项的多肽，其中当m为2或大于2之整数时，该等[(Ab
a
)
‑
(L
b
)]单元不同。40.如权利要求1至37中任一项的多肽，其中当m为大于2之整数时，该等[(Ab
a
)
‑
(L
b
)]单元包含相同及不同单元。41.如前述权利要求中任一项的多肽，其中当n为2或大于2之整数时，该等[(L
c
)
‑
(Ab
d
)]单元相同。42.如权利要求1至40中任一项的多肽，其中当n为2或大于2之整数时，该等[(L
c
)
‑
(Ab
d
)]单元不同。43.如权利要求1至40中任一项的多肽，其中当n为2或大于2之整数时，该等[(L
c
)
‑
(Ab
d
)]单元包含相同及不同单元。44.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该一或多个连接子包含抗体或其抗原结合片段之铰链区。45.如权利要求44的多肽，其中该铰链区系来自IgG1、IgG2或IgG4。46.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该一或多个连接子中之每一者的长度独立地为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。47.如权利要求46的多肽，其中该一或多个连接子中之每一者独立地为柔性连接子、螺旋状连接子或刚性连接子。48.如权利要求47的多肽，其中该一或多个连接子包含柔性连接子和/或刚性连接子。49.如前述权利要求中任一项的多肽，其中L
c
为刚性连接子。50.如权利要求47至49中任一项的多肽，其中该柔性连接子包含GS连接子。51.如权利要求47至50中任一项的多肽，其中该柔性连接子包含SEQ ID NO:7中所阐述之氨基酸。52.如权利要求51的多肽，其中该柔性连接子包含SEQ ID NO:7中所阐述之氨基酸序
列，且其中n为2、3、4、5或大于5之整数。53.如权利要求47至52中任一项的多肽，其中该刚性连接子包含多个PA重复。54.如权利要求53的多肽，其中该刚性连接子系选自PAPAPKA(SEQ ID NO:8)；APAPAPAPAPKA(SEQ ID NO:9)；APAPAPAPAPAPAPAPAPAPKA(SEQ ID NO:10)；或其组合。55.如权利要求47的多肽，其中该螺旋状连接子包含SEQ ID NO:15中所阐述之氨基酸序列。56.如权利要求55的多肽，其中该螺旋状连接子系选自AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:12)；AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:13)；AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:14)；或其组合。57.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该二聚域包含与SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。58.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该二聚域进一步包含与SEQ ID NO:29至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。59.如前述权利要求中任一项的多肽，其中m为2、3、4、5或大于5之整数。60.如前述权利要求中任一项的多肽，其中n为3、4、5或大于5之整数。61.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该多肽系选自由以下组成之群：X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
Y(式II)；X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
(L
c2
)
‑
(Ab
d2
)
‑
Y(式III)；X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b2
)
‑
(Ab
a2
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
Y(式IV)；X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b2
)
‑
(Ab
a2
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
(L
c2
)
‑
(Ab
d2
)
‑
Y(式V)X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b2
)
‑
(Ab
a2
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
(L
c2
)
‑
(Ab
d2
)
‑
(L
c3
)
‑
(Ab
d3
)
‑
Y(式VI)；X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b3
)
‑
(Ab
a2
)
‑
(L
b2
)
‑
(Ab
a3
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
(L
c2
)
‑
(Ab
d2
)
‑
Y(式VII)；X
‑
(Ab
a1
)
‑
(L
b3
)
‑
(Ab
a2
)
‑
(L
b2
)
‑
(Ab
a3
)
‑
(L
b1
)
‑
(DD)
‑
(L
c1
)
‑
(Ab
d1
)
‑
(L
c2
)
‑
(Ab
d2
)
‑
(L
c3
)
‑
(Ab
d3
)
‑
Y(式VIII)。62.如权利要求61的多肽，其中L
c1
、L
c2
和/或L
c3
为刚性连接子。63.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该抗原结合域系选自由以下组成之群：单域抗体(sdAb)、重链可变区(VH或VHH)、轻链可变区(VL或VLL)、单链可变片段(ScFv)、V
NAR
片段及其组合。64.如权利要求63的多肽，其中该抗原结合域包含sdAb。65.如权利要求63的多肽，其中该抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：加拿大商木曾路生物科技公司，
类型：发明
国别省市：