一种针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法技术

本发明专利技术公开了一种针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，具体为：先将VLPs类型抗原与第一佐剂复合物混合后首次免疫动物，再将VLPs类型抗原与第二佐剂复合物混合后进行增强免疫；其中，第一佐剂复合物包括弗氏佐剂，第二佐剂复合物包括水乳佐剂，第一佐剂复合物和第二佐剂复合物中还包括CPG

【技术实现步骤摘要】
一种针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种针对VLPs类型抗原的组合免疫产生高效价血清的方法。

技术介绍

[0002]病毒样颗粒(virus
‑
like particles,VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，其在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。此外，多数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力。
[0003]VLPs类型抗原是一种以VLPs为载体的新型抗原，具体为：将目的抗原的基因片段插入到VLPs的外膜结构中，形成嵌合型VLPs的整体，通过培养复制VLPs来表达蛋白，最终使抗原展示在表面的整体结构的VLPs抗原。该类型的结构是不改变VLPs的表面结构，但又能让目的抗原在其表面，在免疫的过程中能充分的展示出抗原的特质，从而达到免疫的效果。
[0004]佐剂常与抗原共同注入动物体内，以产生预期的高效价免疫血清，佐剂的选择对于免疫的效价至关重要。适当的佐剂可以提高动物机体对免疫原刺激的应答能力，还能延长抗原的半衰期，降低抗原的直接毒性作用，并使抗原在免疫部位缓慢、持久释放，从而提高巨噬细胞和免疫活性细胞的作用。市场使用最广泛的是复合佐剂中的弗氏佐剂和有机佐剂的水乳型佐剂，每种类型的佐剂都有它本身的特殊性，不能针对于不同类型的抗原产生相同的免疫效果。
[0005]然而，目前市面上没有任何一款佐剂被指明可以针对VLPs类型抗原，并在不破坏VLPs和抗原结构的前提下能够有很强的免疫效果，其原因在于：
①
VLPs类型抗原是通过VLPs的表面结构来展示的，而VLPs本身有很强的免疫原性，在免疫过程中VLPs本身也会对宿主有刺激作用，产生效价，进而影响特异抗原的免疫原性，导致特异性抗原的效价很低，甚至免疫失败；
②
VLPs类型抗原是通过抗原表达在VLPs的膜上，本身也不稳定，如果通过物理或者过强化学方式可能会影响细胞膜从而导致特异性抗原失效。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中VLPs类型抗原免疫效价低或免疫失效的问题，本专利技术旨在提供一种针对VLPs类型抗原获得更高免疫效价的免疫方法，以得到具有较高效价的免疫动物，从而提高免疫成功率，缩短研发周期，节约研发成本。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体为：
[0008]一种针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，包括以下步骤：
[0009]S1、将VLPs类型抗原与第一佐剂复合物混合后首次免疫动物，所述第一佐剂复合物包括弗氏佐剂；
[0010]S2、再将VLPs类型抗原与第二佐剂复合物混合后进行增强免疫，所述第二佐剂复合物包括水乳佐剂；
[0011]所述第一佐剂复合物和第二佐剂复合物还包括CpG
‑
C(胞嘧啶多鸟嘌呤C)和/或氯化锰。
[0012]在上述方法中，所述动物优选为小鼠。
[0013]在上述方法中，所述VLPs类型抗原与第一佐剂复合物或第二佐剂复合物优选按照体积比1:1混合。
[0014]在上述方法中，在所述第一佐剂复合物或第二佐剂复合物中，CpG
‑
C的浓度为30～50μg/ml，氯化锰的浓度为90～120μg/ml；其中，CpG
‑
C的浓度优选为40μg/ml，氯化锰的浓度优选为100μg/ml。
[0015]在上述方法中，采用皮下结合肌肉注射的方式免疫动物。
[0016]在上述方法中，所述增强免疫的次数为1～5。
[0017]弗氏佐剂是一种经典的油包水型佐剂，该佐剂是由矿物油(石蜡油)、乳化剂(羊毛脂)和死的结核分枝杆菌组成，若三种成分都有，则称为完全佐剂，若无分枝杆菌则被称为弗氏不完全佐剂。在上述方法中，步骤S1中的第一佐剂复合物优选包含的是弗氏完全佐剂。
[0018]在上述方法中，水乳佐剂又称为水溶性佐剂，是一种与抗原混合后可以直接免疫而不用乳化的佐剂类型；具体可以为PR40009(武汉三鹰)或/和KX0210049(博奥龙)。
[0019]本专利技术的有益效果为：本专利技术通过特定复合佐剂的组合免疫法来降低VLPs本身的免疫原性，同时提高特异性抗原的免疫原性，而且该组合免疫方法不会破坏VLPs细胞膜以及细胞膜上的特异性抗原，最终得到了针对特异性抗原的高效价血清。
具体实施方式
[0020]为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0021]下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0022]实施例1
[0023]本例的VLPs类型抗原具体为GPRC5D
‑
VLPs抗原，第一佐剂复合物由弗氏完全佐剂、CpG
‑
C和氯化锰组成，第二佐剂复合物由博奥龙KX0210049(水乳佐剂)、CpG
‑
C和氯化锰组成，在第一佐剂复合物和第二佐剂复合物中，CpG
‑
C的浓度均为40μg/ml，氯化锰的浓度均为100μg/ml。
[0024]本例的免疫过程具体为：
[0025]实验组：将GPRC5D
‑
VLPs抗原与第一佐剂复合物按照体积比1:1的比例混合乳化，采用皮下结合肌肉注射免疫的方式首次免疫小鼠；待14天后，再将GPRC5D
‑
VLPs抗原与第二佐剂复合物按照体积比1:1的比例混合，进行第二次免疫，免疫方式同首次免疫；待14天后，进行第三次免疫，免疫试剂及免疫方式同第二次；每针每次的50μg；
[0026]对照组：除采用VLPs作为抗原外，其他同实验组。实验组和对照组均分别进行两次实验。
[0027]待最后一次免疫结束7天后采集各组免疫小鼠血液，收集抗血清，通过以下方法检测抗血清的效价：
[0028]①
抗原用CB稀释成2μg/ml，每孔100μl包被到96孔板中，4度过夜；
[0029]②
拍干板子，4％的脱脂奶粉每孔200ul进行封闭，37度2小时；
[0030]③
TBS洗板5次，每次1分钟；用PBS稀释抗血清，按照1:1000，1:2000，1:4000，1:8000
·····
1：1024000的稀释比例后，每孔加100ul，37度1小时；
[0031]④
TBS洗板3次，每次1分钟；洗完后，羊抗小鼠二抗(1:5000)，每孔100ul；
[0032]⑤
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将VLPs类型抗原与第一佐剂复合物混合后首次免疫动物，所述第一佐剂复合物包括弗氏佐剂；S2、再将VLPs类型抗原与第二佐剂复合物混合后进行增强免疫，所述第二佐剂复合物包括水乳佐剂；所述第一佐剂复合物和第二佐剂复合物还包括CPG
‑
C和/或氯化锰。2.根据权利要求1所述针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，其特征在于，所述动物为小鼠。3.根据权利要求1所述针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，其特征在于，所述VLPs类型抗原与第一佐剂复合物或第二佐剂复合物按照体积比1:1混合。4.根据权利要求1所述针对VLPs类型抗原免疫产生高效价抗血清的方法，其特征在于，在所述第一佐剂复合物或第二佐剂复合物中，CpG
‑
C的浓度为30～50μg/ml。5.根据权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，易汪雪，李晶晶，王婷，周文祥，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：