一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法技术

本发明专利技术公开了一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，属于鱼类多样性研究领域。该方法在现有技术基础上，在DNA提取步骤中加入转化了单拷贝质粒的大肠杆菌，通过单拷贝质粒的提取效率来校正DNA提取的误差，使获得的样品中DNA拷贝数更加准确；在PCR扩增步骤中加入梯度参照物，扩增后测序获得梯度参照物的reads数，拟合得到DNA拷贝数与reads数之间的线性斜率，结合测序获得的样品DNA的reads数，计算样品中DNA拷贝数。通过DNA提取、PCR扩增和测序的联合校正，弥补了现有方法中未考虑DNA提取过程和PCR过程误差的不足，可以使得测序数据更好地反映鱼类的绝对丰度，具有大规模推广应用的潜力。广应用的潜力。广应用的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法


[0001]本专利技术属于鱼类多样性研究领域，具体涉及一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法。

技术介绍

[0002]鱼类作为水生生态系统的重要组成部分，能够反映水生生态系统的生物多样性水平，因此对鱼类生物量评估具有重要意义。目前用于鱼类生物量评估的方法主要有标记重捕法、声学探测法和分子生物学法等。标记重捕法是通过对水体中的鱼类进行标记后再捕捞，进行鱼类物种数量的统计，该方法存在(a)标记的选取及放置需要大量损耗人力、物力，(b)需要足够大的数量，成本投入较大且难以保证准确性，(c)难以保证被捕获鱼类的存活，对于鱼类资源有一定的破坏，(d)对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，无法有效进行标记和重捕，难以取得良好的效果等问题，其调查结果容易产生偏差；声学探测法则利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估，可以做到环境友好的、高效的对鱼类种群数量、密度等进行研究，但是该技术受到水域理化指标和天气状况的限制，而且对于大面积水域的调查仍有很大的局限性，在物种鉴定方面，该方法也无法实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取样品DNA获得DNA提取物，在提取时加入已知拷贝数的参照物DNA，提取完成后检测DNA提取物中参照物DNA的拷贝数；(2)PCR扩增，以步骤(1)中的DNA提取物为模板，利用鱼类12S通用引物进行扩增；(3)PCR扩增结果测序，对步骤(2)中PCR扩增结果进行纯化、建库、测序，获得原始reads数；(4)DNA提取效率校正，包括如下方法：a)根据以下的公式计算样品的DNA提取效率：η＝D
提取后
÷
D0其中，η——某个样品的DNA提取效率；D
提取后
——提取完成后DNA提取物中参照物DNA的拷贝数，D0——DNA提取时加入样品中的参照物DNA的拷贝数；b)根据以下公式计算得到校正后的样品reads数：R
D
＝R0÷
η其中，η——某个样品的DNA提取效率；R
D
——该样品进行DNA提取效率校正后的reads数，R0——该样品的原始reads数。2.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入已知拷贝数的参照物DNA是通过加入已知菌体浓度的大肠杆菌进行，上述大肠杆菌转化了包含目的基因片段A的单拷贝质粒，上述目的基因片段A包括可以进行qPCR的特异性片段。3.根据权利要求2所述的一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述步骤(1)检测DNA提取物中参照物DNA的拷贝数包括通过检测提取后单拷贝质粒的拷贝数确定，单拷贝质粒的拷贝数通过qPCR技术检测单拷贝质粒中目的基因片段A的拷贝数确定。4.根据权利要求3所述的一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述大肠杆菌的制备包括将目的基因片段A连接到单拷贝质粒上；将连接后的单拷贝质粒转化到大肠杆菌中并扩大培养；测定菌液浓度、计算菌体个数；和/或单拷贝质粒为pCC1BAC；和/或上述大肠杆菌为Escherichia coli EPI300。5.根据权利要求4所述的一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述基因片段A的序列包括：GTCTTACAGTGTTCACCGTAGGCGCTGTGCAATATTAGTTTCTGACCTCCATTAGGTAGTTTCCCATAGTGCAAGGTCATACAAGGCGAGGCTAT；和/或所述qPCR的引物为：pCC1F，GTCTTACAGTGTTCACCGTAGGC；pCC1R，ATAGCCTCGCCTTGTATGACCTT。。6.根据权利要求1
‑
5任一所述的一种基于环境DNA宏条形码技术的鱼类定量方法，其特征在于，所述方法还包括PCR扩增和测序过程校正，包括：在步骤(2)中，PCR扩增过程中加入不同浓度的三种内标DNA片段混合物，所述三种内标DNA片段两端相同且均为鱼类通用引物设计区，不同在于三种内标DNA片段包括在上述鱼类
通用引物设计区相同位置插入12～20bp的长短相同但序列不同的随机序列，上述位置位于PCR扩增中设计的鱼类12S通用引物序列之间；在步骤(3)中，测序后可以通过随机序列识别三种内标D...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江华，钱林皓，张效伟，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：