一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种评估四指马鲅种群遗传多样性的SSR标记引物，所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示，该引物扩增稳定，多态性强，杂合度高；还公开了一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法。以及上述引物或方法在四指马鲅种群遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。助育种中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及应用，尤其是涉及一种基于四指马鲅简易基因组测序获得的评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及其在野生四指马鲅群体的遗传多样性中的应用。

技术介绍

[0002]四指马鲅（Eleutheronematetradactylum）属于辐鳍鱼纲（Actinopterygii）鲻形目(Perciformes)马鲅亚目(Percoidei)马鲅科(Polynemidae)，是一种暖水性中小型肉食性鱼类，喜欢栖息于近海、河口以及海床地带，主要分布于热带海域，如印度、印度尼西亚、新加坡、菲律宾、澳洲西部和北部等地，在我国渤海、黄海、东海、南海等地区也有分布，其肉质鲜美，营养价值高，很受消费者欢迎，是我国重要的海水养殖名贵鱼类。近年来，由于人类的过度捕捞、水体污染、种质资源的保护意识不强等因素，野生四指马鲅数量急剧下降，但关于四指马鲅种群遗传多样性的研究进展却十分缓慢，未见文献报道，所以对我国四指马鲅的遗传多样性研究刻不容缓。
[0003]简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR），即微卫星标记。微卫星标记是由核心序列和侧翼序列组成，核心序列由1
‑
6个核苷酸组成单元，单元重复次数不低于5次的简单重复序列。SSR广泛分布于真核生物基因组和转录组中，因此成为真核生物基因组水平遗传多样性评估的有效方法。SSR是共显性标记，可直接反应物种的遗传信息。由于在DNA复制过程中滑链导致错配概率大，所以SSR相比于双等位基因标记SNP（Single Nucleotide Polymorphism）和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）具有更高的多态性和杂合性。微卫星标记两端的侧翼序列在亲缘关系比较近的物种基因组中具有保守性，所以某一物种已经开发的微卫星标记可以应用到近缘物种的相关研究，即SSR具有通用性，这一特性大大的减少了开发微卫星标记的工作量。微卫星标记具有分布广泛、共显性标记、通用性等优点，所以开发四指马鲅微卫星标记可以为我国四指马鲅野生资源调查和种质资源保护提供技术支撑和理论依据，为四指马鲅分子标记辅助育种打下基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物，该引物扩增稳定，多态性强，杂合度高。
[0005]本专利技术的目的还在于提供一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，该方法基于10重荧光PCR反应体系，准确度高。
[0006]本专利技术的最后一个目的在于提供上述引物或方法在四指马鲅群体遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种方面的应用。
[0007]本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种评估四指马鲅群体
遗传多样性的SSR标记引物，所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示。
[0008]10对引物的序列具体如下所示：引物对1：F:AGAAACCGACAGAGTATAAG；R:ACTTCGACATACACTTCACG。
[0009]引物对2：F:TCACTTTGGGAAAAAGTTGGTG；R:AATGAACTGCGAGATTAGTT。
[0010]引物对3：F:AGCCGGGGTCTCAGTGGGTC；R:TCCAGACAATCAGCGGTGGT。
[0011]引物对4：F:TGCTTCTGGGTTGGCTGTGG；R:GCCATAACAAATCCGGTACT。
[0012]引物对5：F:TCTGTAATGGCCGGAGCTGG；R:AGCATTTGAAGGAATAAGCT。
[0013]引物对6：F:ACCATTGGAAATGGAGTGGC；R:TGAGTATAGCAGAGTTGTTA。
[0014]引物对7：F:TTGTGTGCCCCTGCACGTTC；R:ACACGGGGCTATGTCTTAGC。
[0015]引物对8：F:CATTCACATGGCATTGCTGGC；R:CTGGTAAGACGGTGAGAAC。
[0016]引物对9：F: GGATTCTGCCGGTGCCGCGACCC；R: CACAC GCTGA ATTCT TCTGGGAAT。
[0017]引物对10：F: AAAGTCTGAAGATGTGATGT；R: CCATACTTCATGTGTGTTCT。
[0018]本专利技术的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：（1）取四指马鲅鳍条组织，提取DNA，进行简易基因组高通量测序，提取高质量序列，对基因组序列区进行搜索，预测微卫星分子标记，并合成标记引物，在四指马鲅DNA中进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出微卫星标记引物；
（2）根据步骤（1）中获得的有效微卫星分子标记引物，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出权利要求1中的10对SSR标记引物；（3）根据步骤（2）中筛选得到的10对SSR标记引物，在每对引物的正向引物5
’
端分别用不同的荧光基团进行修饰，开发一个10重荧光PCR反应体系；（4）收集四指马鲅群体样本，提取DNA，利用步骤（3）中的10重荧光PCR反应体系进行扩增，然后进行基因分型，评估四指马鲅群体遗传多样性。
[0019]在上述评估四指马鲅群体遗传多样性的方法中：优选的，步骤（1）和步骤（4）中采用醋酸铵法提取组织DNA。
[0020]优选的，步骤（1）中在基因组序列上开发微卫星标记。
[0021]优选的，步骤（1）中筛选出扩增稳定、条带清晰且单一的有效微卫星标记引物。
[0022]优选的，步骤（2）中筛选10对SSR标记引物的过程是：根据基因组测序筛选的微卫星标记，合成引物，并分别对四指马鲅个体进行PCR扩增，电泳检测扩增产物大小，收集数据，分析SSR的遗传学参数，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的10对SSR标记引物。
[0023]优选的，步骤（3）中在每对引物的正向引物5
’
端标记荧光物质时，其中引物对1、引物对7和引物对10标记荧光物质FAM；引物对2、引物对4、引物对6和引物对8标记荧光物质HEX；引物对引物对3、引物对5和引物对9标记荧光物质TAMRA。
[0024]优选的，步骤（3）中所述10重荧光PCR反应体系如下：
[0025]优选的，步骤（4）中采用ABI 3730XL进行基因型分型，对四指马鲅遗传多样性进行分析包括：利用软件Cervus计算微卫星标记在群体中的等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和哈代温伯格平衡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物，其特征是所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示。2.一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，其特征是包括以下步骤：（1）取四指马鲅鳍条组织，提取DNA，进行简易基因组高通量测序，提取高质量序列，对基因组序列区进行搜索，预测微卫星分子标记，并合成标记引物，在四指马鲅DNA中进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出微卫星标记引物；（2）根据步骤（1）中获得的有效微卫星分子标记引物，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出权利要求1中的10对SSR标记引物；（3）根据步骤（2）中筛选得到的10对SSR标记引物，在每对引物的正向引物5
’
端分别用不同的荧光基团进行修饰，开发一个10重荧光PCR反应体系；（4）收集四指马鲅群体样本，提取DNA，利用步骤（3）中的10重荧光PCR反应体系进行扩增，然后进行基因分型，评估...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晋，卢丹琪，黄舜梅，赖文杰，汤胜亮，李水生，张勇，
申请(专利权)人：珠海市龙胜良种鱼苗培育有限公司，
类型：发明
国别省市：