基于特异序列标签的创伤弧菌exo-RPA快速检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了用于检测创伤弧菌的特异序列标签，以及在此基础上基于exo

【技术实现步骤摘要】
基于特异序列标签的创伤弧菌exo
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RPA快速检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及基于特异序列标签和exo
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RPA(荧光法RPA)技术的创伤弧菌的检测分析方法及所用试剂与应用。

技术介绍

[0002]创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种广泛分布于海水和水产品中的革兰氏阴性弧菌，与霍乱弧菌、副溶血弧菌并称为人类三大致病性弧菌。当前世界上大部分沿海国家均有创伤弧菌的致病报道，因创伤弧菌急性感染引起的脓毒症患者，在3～4d内出现腹腔内广泛性坏死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公众饮食健康的重大威胁之一，所以对创伤弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义。
[0003]针对创伤弧菌开发出特异、快速、灵敏的检测方法对挽救患者生命具有积极作用。目前，公认检测的常用方法主要有分离培养病原菌，酶联免疫吸附测定(ELISA)，实时荧光定量PCR(qPCR)等。这些方法虽然可准确的检测到创伤弧菌，但是较长的测定时间(不少于几个小时)，昂贵且庞大的仪器(如qPCR仪器)，专业的实验人员和较高的实验环境要求限制了野外及现场检测。重组酶聚合酶介导的扩增技术(RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，由于RPA扩增方式无需复杂的温度改变，且扩增反应时间短，与配对的检测荧光探针结合的exo
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RPA法最短在10分钟内就能得到明显的阳性结果，适合用于现场快速检测。
[0004]创伤弧菌SNP突变频率高,有研究分析了260株创伤弧菌的全基因组序列，变异检测发现229462个SNP变异。但随着高通量测序技术的快速发展，使得短时间内能够获得大量创伤弧菌相关基因组数据。这些海量数据使得通过生物信息学分析方法获得创伤弧菌的核心基因组特异序列标签成为可能。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何快速、灵敏的检测创伤弧菌。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了用于检测创伤弧菌的特异序列标签，所述特异序列标签核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA。
[0007]本专利技术还提供了一种鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的试剂，所述试剂包括引物Vv
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F2、引物Vv
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R1和探针Vv
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P；所述引物Vv
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F2是核苷酸序列为SEQ ID No.3的单链DNA，所述引物Vv
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R1是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA，所述探针Vv
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P的结构为核苷酸片段1
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四氢呋喃残基
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核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.10，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQ ID No.11，SEQ ID No.10的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.11的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3
’
端进行阻断修饰。
[0008]上述试剂中，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述SEQ ID No.11的3
’
端连接C3
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spacer。
[0009]本专利技术还提供了检测创伤弧菌的试剂盒。
[0010]本专利技术提供的试剂盒含有上述试剂。
[0011]所述试剂盒还含有Genie II等温扩增荧光检测试剂。
[0012]所述试剂盒含有重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子。
[0013]本专利技术还提供了用于鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的引物组合物。
[0014]所述引物组合物包括上述引物Vv
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F2和引物Vv
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R1。
[0015]本专利技术还提供了鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的方法。
[0016]在一种实施例中，所述方法包括以待测样本的DNA为模板，用上述试剂或试剂盒进行exo
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RPA检测，获得荧光值；根据所述荧光值确定待测样本是否含有创伤弧菌。
[0017]所述待测样本可为环境样品(如水)或作为食品的动物组织和/或器官等。
[0018]本专利技术还提供了上述试剂或试剂盒在如下任一中的应用：
[0019](1)检测或辅助检测创伤弧菌；
[0020](2)制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品。
[0021]本专利技术还提供了上述引物组合物在如下任一中的应用：
[0022](1)检测或辅助检测创伤弧菌；
[0023](2)制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品；
[0024](3)扩增创伤弧菌DNA；
[0025](4)制备扩增创伤弧菌DNA的产品。
[0026]上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
[0027]RPA的等温扩增反应使用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统完成，该系统紧凑小巧，轻便耐用，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可实现便携式的致病菌现场快速检测，摆脱了实时荧光定量PCR(qPCR)等精密仪器的依赖，使得exo
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RPA技术在创伤弧菌现场诊断方面具有广阔的应用前景。本专利技术用于创伤弧菌的exo
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RPA检测引物和探针，将此引物组及其配对荧光探针用于基于exo
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RPA技术的基因检测中可快速现场检测创伤弧菌，具有特异性好，灵敏度高，反应十分快速的优点，为创伤弧菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。
附图说明
[0028]图1为创伤弧菌exo
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RPA引物对的筛选。
[0029]图2为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术灵敏度评价。注：A.灵敏度荧光图，从上至下各扩增曲线使用基因组DNA浓度分别为100、10、1、0.5aM(1aM＝3.3fg/μL)；B.独立重复性检测图，n＝5次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
[0030]图3为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术灵敏度评价。注：A.灵敏度荧光图，从上至下各扩增曲线使用阳性质粒模板浓度分别为960
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0.2拷贝/μL；B.独立重复性检测图，n＝3次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
[0031]图4为创伤弧菌实时荧光RPA检测技术的特异性检验。注：A.特异性荧光图；B.28株
创伤弧菌荧光图。
具体实施方式
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测创伤弧菌的特异序列标签，其特征在于，所述特异序列标签核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA。2.鉴定或辅助鉴定创伤弧菌的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物Vv
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F2、引物Vv
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R1和探针Vv
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P；所述引物Vv
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F2是核苷酸序列为SEQ ID No.3的单链DNA，所述引物Vv
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R1是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA，所述探针Vv
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P的结构为核苷酸片段1
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四氢呋喃残基
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核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为SEQ ID No.10，核苷酸片段2的核苷酸序列为SEQ ID No.11，SEQ ID No.10的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.11的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3
’
端进行阻断修饰。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述SEQ ID No.11的3
’
端连接C3
‑
spacer。4.检测创伤弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁兵，袁媛，张嘉鑫，徐健皓，王景林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：