一种动物组织冷冻保护用组合试剂及其应用和方法技术

本发明专利技术涉及一种动物组织冷冻保护用组合试剂及其应用和方法，具体而言，涉及一种用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂，该组合试剂在动物组织冷冻保护中的应用，以及使用该组合试剂对动物组织冷冻的方法。本发明专利技术的组合试剂及其应用和方法可结合冰冻切片技术来对动物组织进行切片研究，并在完全维持组织形态的同时非常有效地减少了冰晶的形成。同时非常有效地减少了冰晶的形成。同时非常有效地减少了冰晶的形成。

【技术实现步骤摘要】
一种动物组织冷冻保护用组合试剂及其应用和方法


[0001]本专利技术涉及对动物组织进行冷冻保护的
，具体的说是涉及一种用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂，该组合试剂在动物组织冷冻保护中的应用，以及使用该组合试剂对动物组织冷冻的方法。

技术介绍

[0002]为了多尺度、高分辨、系统性地研究离体生物组织结构，通常需要对生物组织进行组织切片(Tissue sectioning)，并对切片进行分子标记与成像。切片是组织处理中至关重要的一步，切片的质量决定了组织样本的可靠性，以及是否有可能还原成切片前的三维状态，这对于许多生物研究以及临床的病例检验是非常重要的。
[0003]其中冷冻切片使用冷冻切片机切割冷冻的生物组织，由于冷冻的组织具有一定的硬度，故可以被切成厚薄均匀的薄片(通常为20至80微米)。冷冻切片被大量应用于快速病理检测，由于其处理过程对生物大分子没有不可逆的损害，所以常用于荧光成像、各类免疫染色等研究方法中。对荧光成像的兼容性使其可以进行三维结构的成像。然而如何使组织在冷冻过程中不受冰晶损伤而破坏原有结构是冷冻切片技术最大的挑战之一。
[0004]现有技术中提出了用多种物质作为生物样品冷冻保护剂，例如CN110250162A中将特定蛋白，例如RNA结合蛋白与诸如人血清白蛋白、丙二醇、乙二醇、蔗糖等结合使用。
[0005]CN108112575A采用糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖等进行组合作为细胞或组织冷冻保护试剂。
[0006]目前常规的冷冻保护(cryopreservation)方法使用20重量％蔗糖PBS和30重量％蔗糖PBS对动物组织进行梯度脱水，然而动物组织会在脱水过程中显著缩小体积，改变形态。且尽管进行了脱水，组织在冷冻过程中依然会形成冰晶，不可逆地破坏了细胞的结构，并且在切片时由于组织脆性大，容易造成断面的损伤，这样的损伤使得冰冻切片很难切得更薄(20微米以下)。在贴片复温时，切片在融化过程中会产生显著的重结晶(recrystallization)，进一步扩大冰晶的损伤。此外，传统的冷冻切片过程后，通常需要对贴在玻片上的切片进行晾干甚至烘干以保证其不会轻易从载玻片上脱落，但是此过程中水分会从脑片被结晶破坏的空洞中蒸发，进一步扩大孔洞，形成海绵状结构，此干燥过程除了破坏组织的形态结构也会破坏生物分子的结构，因而对分子标记的效果产生影响或增强成像时的背景荧光。再其后会使用PBS进行漂洗，此过程中由于蔗糖脱水的缩小脑组织渗透压恢复到了蔗糖脱水之前，故组织切片会在玻片上膨胀，造成皱缩甚至脱片(图1的a)可见传统的冷冻保护剂，例如蔗糖脱水是不完善的冷冻保护，只能以有限的效果减少冰晶的生成，却在切片时组织的力学特征上，在切片的复温过程中，在切片的干燥过程中，在贴片的复水过程中缺乏对组织宏观结构、分子结构的保护。这样的不足限制了冰冻切片在揭示微观生物系统结构的可靠性(图3的a和b)，增加了研究者整合多尺度数据至组织整体结构的难度。
[0007]现有技术中还没有能够在减少冷冻过程中冰晶的形成以及在切片复温和干燥过程中减少对组织形态和分子结构的损害方面均取得满意效果，从而在宏观和微观尺度上均
能够保持样本完好的冷冻保护试剂。

技术实现思路

[0008]技术问题
[0009]本专利技术目的在于提供一种在宏观上完全维持组织尺寸、结构，在微观上充分保护生物分子的结构，在冷冻过程中只形成很少、很小的冰晶，在切片过程中有良好的力学特性、避免断裂损伤而可以进行更薄、断面更平整的切片，在复温过程中充分抑制重结晶，在晾片过程中保护组织免受干燥的影响，在复水后使切片不膨胀、不皱缩的冷冻保护方法。该方法将使冷冻切片技术可以完整保持组织的空间结构、分子结构，使利用使用冰冻切片完全还原多尺度三维组织结构成为可能。
[0010]技术方案
[0011]针对现有技术中的问题，以及为了实现本专利技术的目的，本申请提供了一种用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂，所述组合试剂包含：
[0012]促渗透分子，
[0013]非渗透性糖类冷冻保护分子，
[0014]渗透性冷冻保护分子，和
[0015]重结晶抑制分子。
[0016]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述组合试剂还包含：
[0017]缓冲成分，优选pH＝7.2至7.4的缓冲成分，例如pH＝7.2至7.4的0.01M磷酸缓冲液，和
[0018]固定成分，优选4重量％多聚甲醛。
[0019]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述促渗透分子是选自由以下组成的组中的任一种或多种的组合：
[0020]类胆酸盐，优选胆酸钠，脱氧胆酸钠，石胆酸钠，鹅脱氧胆酸钠或其他类胆酸盐；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，类胆酸盐浓度在0.5重量％至5重量％，
[0021]含脂肪酸链的甜菜碱类两性离子表面活性剂，优选月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱，月桂酰胺丙基甜菜碱，十二/十四烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱，十二烷基二甲基甜菜碱或其他同类试剂；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含脂肪酸链的甜菜碱类两性离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，
[0022]含胆酸侧链的甜菜碱类两性离子表面活性剂，优选CHAPS(3
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[3
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(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含胆酸侧链的甜菜碱类两性离子表面活性剂浓度在0.5重量％至5重量％，
[0023]含脂肪酸链的阴离子表面活性剂，优选十二烷基硫酸钠，十二烷基苯磺酸钠；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含脂肪酸链的阴离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，
[0024]非离子表面活性剂，优选tritonX
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100等；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，非离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，
[0025]其中，相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，所述促渗透分
子的总浓度为0.5重量％至10重量％。
[0026]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述促渗透分子为1重量％脱氧胆酸钠或3重量％月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱。
[0027]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述非渗透性糖类冷冻保护分子是选自由海藻糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、半乳糖组成的组中的任一种或多种的组合，
[0028]相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，所述非渗透性糖类冷冻保护分子的总浓度为3重量％至40重量％。
[0029]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述非渗透性糖类冷冻保护分子是10重量％至35重量％的海藻糖。
[0030]在本专利技术所述组合试剂的一个实施方式中，所述渗透性冷冻保护分子是选自由乙二醇、二甲基亚砜、1,2
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丙二醇、甘油、甘氨酸甜菜酯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂，所述组合试剂包含：促渗透分子，非渗透性糖类冷冻保护分子，渗透性冷冻保护分子，和重结晶抑制分子。2.如权利要求1所述的组合试剂，其中，所述促渗透分子是选自由以下组成的组中的任一种或多种的组合：类胆酸盐，优选胆酸钠、脱氧胆酸钠、石胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，类胆酸盐浓度在0.5重量％至5重量％，含脂肪酸链的甜菜碱类两性离子表面活性剂，优选月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、十二/十四烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱、十二烷基二甲基甜菜碱；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含脂肪酸链的甜菜碱类两性离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，含胆酸侧链的甜菜碱类两性离子表面活性剂，优选CHAPS(3
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[3
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(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含胆酸侧链的甜菜碱类两性离子表面活性剂浓度在0.5重量％至5重量％，含脂肪酸链的阴离子表面活性剂，优选十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，含脂肪酸链的阴离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，非离子表面活性剂，优选tritonX
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100；相对于用于对动物组织进行冷冻保护的组合试剂的总重量，非离子表面活性剂浓度在0.5重量％至10重量％，其中，相对于用于对动物组织进行冷冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑克鑫，高一潇，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：