一种米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及半抗原技术领域，尤其涉及一种米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用。本发明专利技术在米酵菌酸结构基础上选择分别与之两端部分结构相似的两个中间体进行改造和偶联，在特定的位点上增加丙氨基偶联臂，制得带有活性氨基的米酵菌酸半抗原，其与载体蛋白进行生物偶联后可以得到相应的米酵菌酸人工全抗原；利用该米酵菌酸人工全抗原可以制得米酵菌酸抗体，可用于快速、准确地检测出食品中的米酵菌酸。准确地检测出食品中的米酵菌酸。准确地检测出食品中的米酵菌酸。

【技术实现步骤摘要】
一种米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物化工
，尤其涉及一种米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]米酵菌酸(Bongkrekic Acid，BA，C
28
H
38
O7)是由唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(曾用命名“酵米面假单胞菌”、“椰毒假单胞菌酵米面亚种”、“椰毒伯克霍尔德氏菌”等)产生的一种可以引起食物中毒的毒素。米酵菌酸毒性强，可引起人和多种动物的急性中毒，导致神经系统、消化系统及泌尿系统损伤，是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品引起食物中毒的主要原因。由于米酵菌酸性质稳定耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性，而且目前并无有效的米酵菌酸快速检测试剂。
[0003]目前米酵菌酸的检测方法主要为仪器方法，这些方法准确可靠，常作为确证方法，但因设备昂贵、操作要求高、检测耗时长等原因，均难以实现实际应用中大批量样品的快速检测，而基于抗原抗体特异性结合的免疫分析技术能够满足现场快速筛查的需求。因此，研究抗米酵菌酸单克隆抗体的制备对于米酵菌酸的快速检测具有十分重要的经济和社会意义。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用，通过将半抗原与载体蛋白进行生物偶联可以得到人工全抗原，进而制备得到米酵菌酸抗体，可用于快速检测食品中的米酵菌酸。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种米酵菌酸半抗原，所述米酵菌酸半抗原的化学式如式I所示：
[0006][0007]第二方面，本专利技术提供一种米酵菌酸人工抗原，由所述半抗原制备得到。
[0008]进一步地，由所述米酵菌酸半抗原偶联载体蛋白得到，所述载体蛋白优选包括牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白或卵清蛋白中的一种或多种。
[0009]所述米酵菌酸人工抗原结构如下，其中Carrier protein即为载体蛋白。
[0010][0011]本专利技术进一步提供包括所述米酵菌酸半抗原或所述米酵菌酸人工抗原的试剂盒。
[0012]第三方面，本专利技术提供一种杂交瘤细胞株，通过所述的米酵菌酸人工抗原作为免疫原制备得到。
[0013]作为一种优选的具体实施方式，本专利技术提供一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
[0014]利用所述米酵菌酸人工抗原作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，经分析测定，对免疫效果较好的小鼠收集B细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞，经过多轮筛选与克隆，获得效果较好的杂交瘤细胞株。
[0015]进一步地，所述米酵菌酸人工抗原所用载体蛋白为牛甲状腺球蛋白。
[0016]进一步地，所述米酵菌酸人工抗原为半抗原和载体蛋白通过活性酯法偶联得到。
[0017]进一步地，Balb/c小鼠的数量为8只。
[0018]进一步地，所述免疫Balb/c小鼠的方法如下：将所述免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后首次免疫Balb/c小鼠，再将首次免疫中所用的免疫原剂量减半，并用等体积的弗氏不完全佐剂乳化后对首次免疫的Balb/c小鼠进行加强免疫。
[0019]进一步地，所述免疫的方式为颈背部多点免疫，免疫4
‑
8点。
[0020]进一步地，所述免疫原用PBS溶液稀释；
[0021]所述PBS溶液的浓度具体为0.01mol/L，pH为7.4。
[0022]进一步地，所述首次免疫的所述免疫原的剂量为200μg/只，加强免疫剂量为100μg/只；
[0023]所述加强免疫次数为2
‑
3次，优选为3次；
[0024]所述加强免疫优选为在首次免疫后第21天进行一次加强免疫。
[0025]进一步地，本专利技术将制备得到的杂交瘤细胞株提交生物保藏，具体信息如下：
[0026]保藏编号：CGMCC No.21905，保藏日期：2021年03月05日，分类命名：小鼠杂交瘤细胞株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮政编码：100101。
[0027]本专利技术进一步提供所述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。
[0028]进一步地，所述单克隆抗体的重链亚型为IgG1型，轻链亚型为λ型，
[0029]第四方面，本专利技术提供所述米酵菌酸半抗原的制备方法，包括：
[0030](1)以化合物1为出发产物，通过皂化反应得到化合物3；
[0031](2)化合物3与3
‑
氨基
‑1‑
丙醇进行酯化反应得到化合物4；
[0032](3)化合物2通过甲基化反应、皂化反应得到化合物5；
[0033](4)化合物4和化合物5反应得到所述米酵菌酸半抗原；
[0034]其中，化合物1的化学式如式II所示：
[0035][0036]化合物2的化学式如式III所示：
[0037][0038]化合物3的化学式如式IV所示：
[0039][0040]化合物4的化学式如式V所示：
[0041][0042][0043]化合物5的化学式如式VI所示：
[0044][0045]进一步地，步骤(3)中甲基化反应为在三氟甲磺酸甲酯和2,6
‑
二叔丁基吡啶作用下，于55～65℃下进行反应。
[0046]作为一种优选的具体实施方式，本专利技术提供一种米酵菌酸半抗原的制备方法，包
括：
[0047](1)从溶于有机溶剂的化合物1出发，加入KOH后通过热回流反应2～3小时，经过盐析、干燥；
[0048](2)将步骤(1)的产物混合3
‑
氨基
‑1‑
丙醇，加入浓硫酸后经过热回流1～2小时，经过盐析、洗涤、离心和干燥得到化合物4；
[0049](3)从溶于有机溶剂的化合物2出发，在三氟甲磺酸甲酯和2,6
‑
二叔丁基吡啶作用下，于55～65℃下甲基化反应，后经过皂化反应得到化合物5；
[0050](4)将化合物4和化合物5在碱性溶剂中进行Sonogashira偶联反应，通过过滤、浓缩、纯化得到米酵菌酸半抗原。
[0051]本专利技术进一步提供所述米酵菌酸半抗原，所述米酵菌酸人工抗原，所述试剂盒或所述单克隆抗体在检测米酵菌酸或其衍生物中的应用。
[0052]进一步地，所述检测为酶联免疫吸附测定法，优选为通过间接ELISA法，检测米酵菌酸抗血清效价；或，通过间接竞争ELISA法，测定抗体的灵敏度。
[0053]本专利技术具有如下有益效果：
[0054]本专利技术基于米酵菌酸结构得到一种米酵菌酸半抗原，在将其与载体蛋白偶联后即可得到米酵菌酸人工抗原，并且以其作为免疫原制备了抗米酵菌酸的有效单克隆抗体。
[0055]利用本专利技术提供的方法制备得到的米酵菌酸抗体简单易行，并且筛选得到抗体效价为2.5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，所述米酵菌酸半抗原的化学式如式I所示：2.一种米酵菌酸人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的米酵菌酸半抗原制备得到。3.根据权利要求2所述的米酵菌酸人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的米酵菌酸半抗原偶联载体蛋白得到；所述载体蛋白优选包括牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白或卵清蛋白中的一种或多种。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的米酵菌酸半抗原或如权利要求2或3所述的米酵菌酸人工抗原。5.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为通过权利要求2或3所述的米酵菌酸人工抗原作为免疫原制备得到。6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC 21905。7.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求5或6所述的杂交瘤细胞株分泌得到。8.权利要求1所述的米酵菌酸半抗原的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王战辉，沈建忠，温凯，于雪芝，余文博，江海洋，张素霞，邵仕贝，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：