一种合成丙二酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种合成丙二酸的方法，包括酮酸脱酸酶和丙二酸半醛脱氢酶两种酶，实现了以碳代谢中间产物草酰乙酸为底物合成丙二酸。本发明专利技术还公开了可合成丙二酸的重组菌株的构建方法，获得的重组菌株可以应用于丙二酸发酵合成，实现了以简单碳源为底物原料发酵制备丙二酸，因此具有很广泛的应用价值。因此具有很广泛的应用价值。因此具有很广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种合成丙二酸的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种生物合成丙二酸的方法及应用。

技术介绍

[0002]丙二酸又称缩苹果酸，是一种具有三个碳原子的二羧酸，为无色片状晶体，易溶于水，且溶于丙酮、醇和醚等有机试剂中。丙二酸也是制药和化妆品工业中许多产品和工艺的标准组分，主要用于医药中间体，也用于香料、粘合剂、树脂添加剂、电镀抛光剂等。传统方法上丙二酸的合成，主要是通过氯乙酸与碳酸钠反应制得的钠盐与氰化钠反应生成氰基乙酸盐，然后通过氢氧化钠将腈基水解为丙二酸钠，最后用酸化法获得丙二酸。但这种方法获得的丙二酸纯度不高，回收率低，并且在此过程中所使用的的氰化物为剧毒物质，造成严重的环境污染。目前丙二酸主要通过水解丙二酸二甲酯或丙二酸二乙酯来生产，这种方法虽然可以提高产物的收率和纯度，但是原料成本较高，不适合大规模工业化生产。而生物法制备有机酸具有反应条件温和，绿色环保等优势，但由于对其合成途径及关键酶了解有限，目前生物发酵法制备丙二酸的较少。WO2021133722A1公开了能够产生丙二酸、丙二酸酯、丙二酸酯或其混合物的工程微生物，其中工程改造微生物包括丙二酸
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半醛脱氢酶，能够产生约9g/L至约250g/L的丙二酸、丙二酸酯、丙二酸酯或其混合物。所述微生物还包括能够将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为草酰乙酸（OAA）的多肽；能够将丙酮酸转化为草酰乙酸（OAA）的多肽；能够将草酰乙酸 (OAA) 转化为天冬氨酸的多肽；能够将天冬氨酸转化为β丙氨酸的多肽；能够将β丙氨酸转化为丙二酸
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半醛或其混合物的多肽。该文献中以草酰乙酸为底物合成丙二酸
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半醛也需要经过多个步骤，并不经济。
[0003]因此，亟待开发高效的丙二酸生物合成途径及生产菌株，为丙二酸的高效绿色合成提供基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术经过广泛而深入的研究，设计了全新的丙二酸合成途径，并鉴定了途径中所涉及的两个关键酶，酮酸脱羧酶和丙二酸半醛脱氢酶，在体外能够催化草酰乙酸合成丙二酸，并将该新途径导入微生物后，能够以简单碳源葡萄糖为底物合成丙二酸，如此形成了本专利技术。
[0005]为此，本专利技术采用以下技术方案。
[0006]本专利技术第一方面，提供了一种合成丙二酸的方法，其以草酰乙酸为底物，在体外通过两步酶催化反应合成丙二酸。其特征在于，以草酰乙酸为底物，加入酮酸脱羧酶和丙二酸半醛脱氢酶，进行多酶催化反应合成丙二酸。其中，酮酸脱羧酶催化草酰乙酸生成丙二酸半醛，而后丙二酸半醛脱氢酶催化丙二酸半醛生成丙二酸。
[0007]在具体实施方式中，底物草酰乙酸可以是草酰乙酸纯品也可以是采用酸解、酶转化或生物发酵法转化单糖、多糖或其组合获得的草酰乙酸。优选地，所述的单糖选自葡萄
糖，木糖，阿拉伯糖或其组合；所述的聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、半纤维素、蔗糖、淀粉或其组合，优选的为结晶纤维素和木聚糖，或组合。
[0008]在另一优选方式中，底物草酰乙酸可以通过植物生物质发酵转获得，具体地植物生物质包括农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物；其中，所述农作物秸秆包括玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物包括枝叶，锯末；所述能源植物包括甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
[0009]在另一优选方式中，多酶催化反应的反应温度为10
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95℃，进一步优选为20
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80℃，更优选为30
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60℃，最优选为37℃。
[0010]在具体实施方式中，多酶催化反应的体系中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。
[0011]在另一优选方式中，所述酮酸脱羧酶如SEQ ID NO.1所示；或其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或SEQ ID NO.1所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽。
[0012]在另一优选方式中，所述丙二酸半醛脱氢酶如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示；或其氨基酸序列与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或SEQ ID NO.3或 SEQ ID NO.21所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽。
[0013]本专利技术第二方面，提供了一种可合成丙二酸的微生物重组菌株的构建方法，其特征在于，在微生物中引入酮酸脱羧酶和丙二酸半醛脱氢酶基因，通过表达所述基因的酶，以将胞内的草酰乙酸催化合成丙二酸。
[0014]所述微生物重组菌株的构建方法适用于多种但不限于以下微生物，脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、毁丝霉(Myceliophthora)、侧孢霉（Sporotrichum）、镰孢菌（Fusarium）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和拟青霉（Paecilomyces）。优选地，所述菌株是嗜热毁丝霉。
[0015]在具体实施方式中，所述编码酮酸脱羧酶基因编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸廒；或编码的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或者编码了SEQ ID NO.1所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽；所述编码丙二酸半醛脱氢酶的基因编码了如SEQ ID NO.3或 SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；或编码了氨基酸序列与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或者编码了SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽。
[0016]本专利技术第三方面，提供了一种发酵法合成丙二酸的方法，其特征在于，将上述所述构建方法得到的可合成丙二酸的微生物重组菌株，以单糖、聚糖和/或植物生物质为底物发酵生产有机酸。
[0017]在另一优选方式中，所述的底物还包括单糖、多糖或其组合。优选地，所述的单糖
所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合；所述的聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、半纤维素、蔗糖、淀粉或其组合，优选的为结晶纤维素和木聚糖，或组合；所述的植物生物质包括农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物；其中，所述农作物秸秆包括玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成丙二酸的方法，其特征在于，以草酰乙酸为底物，利用酮酸脱羧酶和丙二酸半醛脱氢酶催化合成丙二酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物草酰乙酸为草酰乙酸纯品，或采用酸解、酶转化或植物生物质发酵法转化单糖、多糖或其组合衍生获得产物中的草酰乙酸；进一地，所述的单糖，选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，或其组合；所述的聚糖，选自结晶纤维素、半纤维素，或其组合；所述的植物生物质，选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯，优选为玉米芯。3.如权利要求1
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2任一所述的方法，其特征在于，所述酮酸脱羧酶如SEQ ID NO.1所示；或其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或者SEQ ID NO.1所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽；所述丙二酸半醛脱氢酶如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示；或其氨基酸序列与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；或者SEQ ID NO.21所示的序列经一个或几个氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、具有催化草酰乙酸合成丙二酸半醛的一种或多种由衍生的多肽。4.一种构建可生产丙二酸重组菌株的方法，其特征在于，在菌株中导入编码酮酸脱羧酶和后丙二酸半醛脱氢酶的基因，所获得的能够合成丙二酸的重组菌株。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌株为丝状真菌细胞，选自脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、毁丝霉(Myceliophthora)、侧孢霉（Sporotrichum）、镰孢菌（Fusarium）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和拟青霉（Paecilomyces），更优选地，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）、异梭毁丝霉(Myceliophthora heterothallica)。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述编码酮酸脱羧酶基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：田朝光，顾淑莹，李金根，赵祯，刘倩，陈美欣，刘德飞，孙文良，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：