一种超滤柱的制备及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种超滤柱的制备及使用方法，涉及多肽纯化领域。该方法采用4,6

【技术实现步骤摘要】
一种超滤柱的制备及使用方法


[0001]本专利技术属于多肽纯化
，具体涉及一种超滤柱的制备及使用方法。

技术介绍

[0002]胆囊收缩素（CCK）是由小肠粘膜I细胞释放的一种肽类激素，由33个氨基酸组成，具有刺激胆囊收缩和兴奋胰酶分泌的作用。
[0003]辛卡利特（sincalide）是一种人工合成的胆囊素八肽（Octapeptide），是胆囊收缩素的一个片段，具有胆囊收缩素的全部生物活性。
[0004]其结构式为：H
‑
Asp1‑
Tyr(SO3H)2‑
Met3‑
Gly4‑
Trp5‑
Met6‑
Asp7‑
Phe8‑
NH2，存在络氨酸磺酸化的特殊结构。目前，辛卡利特的制备方法主要有酶法和化学法两种。
[0005]1）酶法酶法合成是以木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和α
‑
胰凝乳蛋白酶等多酶联用，并用液相合成法修饰得到目标产物。酶法存在以下缺陷：涉及酶制剂种类比较多，且酶制剂价格昂贵，不易得；联用液相合成法，导致操作繁琐，产物分离困难。
[0006]2）化学合成法由于辛卡利特存在Tyr(SO3H)这一特殊结构，该结构在酸性条件下不稳定，特别是强酸性条件下。
[0007]目前报道的化学合成方法的专利文献有：CN102775471A、CN101463072A、CN103833842A、CN110317257A、CN104987362A和CN108239148A；上述文献都使用磺酸化络氨酸（Fmoc
‑
Tyr (SO3H)
‑
OH）和其衍生盐（Fmoc
‑
Tyr(SO3Na)
‑
OH，Fmoc
‑
Tyr(SO3Ba
1/2
)
‑
OH，Fmoc
‑
Tyr(SO3NnBu4)
‑
OH等）作为原料，用来引入Tyr(SO3H)这一特殊结构。此类氨基酸价格昂贵，偶联困难，大幅增加合成成本。在引入Tyr(SO3H)结构后：CN102775471A专利文献中采用10℃条件下用TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5（v/v）的酸性溶液，进行裂解脱保护；CN103833842A专利文献中采用0℃条件下用TFA:DCM=90:10（v/v）的酸性溶液，进行裂解脱保护；CN104987362A专利文献中采用
‑
20℃条件下用TFA:TIS:H2O:EDT=94:2.5:2.5:1（v/v）的酸性溶液，进行裂解脱保护；CN110317257A专利文献中采用TFA:DCM=2:98（v/v）的酸性溶液，进行裂解脱保护；CN108239148A专利文献中采用三氟乙醇:二氯甲烷=1:1:2（v/v）或醋酸:三氟乙醇:四氢呋喃=1:1:3（v/v）的酸性溶液处理后再用氢氧化锂溶液处理，进行裂解脱保护。上述文献引入Tyr(SO3H)结构后都使用强酸或者弱酸溶液进行处理，从而影响产物纯度和收率。
[0008]超滤法是一种利用压力或离心力作用，截留多肽的纯化方法，该方法具有操作简单、成本较低等特点，且操作过程中不需要进行加热和干燥处理，可避免某些活性物质出现变性或失活现象。本专利技术公开了一种超滤柱的制备方法，并将其用于辛卡利特的固相合成，来进一步提升产物纯度和收率。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种超滤柱的制备及使用方法，采用该超滤柱制备的辛卡利特纯品具有较高的纯度。
[0010]本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种超滤柱，上述超滤柱包含下层和上层；上述超滤柱下层为硅胶，上层为改性聚苯乙烯；上述硅胶包含C18硅胶；上述改性聚苯乙烯由4,6
‑
二氨基
‑2‑
甲基巯基嘧啶胺基化改性聚苯乙烯而得。
[0011]本专利技术还公开了一种辛卡利特的固相合成方法，包括：步骤一、以Fmoc
‑
Phe
‑
OH作为首个氨基酸用于起始树脂的树脂加载；步骤二、采用固相Fmoc偶联法，将保护氨基酸逐步偶联获得肽树脂；步骤三、肽树脂经酸解、磺酸化、氨解后，获得辛卡利特粗品；步骤四、将辛卡利特粗品采用超滤柱纯化，获得辛卡利特纯品；对本专利技术而言，上述起始树脂选自Merrifield Resin或Pam Resin中的一种。
[0012]对本专利技术而言，上述保护氨基酸包含：Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑
OH，Fmoc
‑
Met
‑
OH，Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
OH，Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
OH和Fmoc
‑
Gly
‑
OH。
[0013]对本专利技术而言，上述酸解中用到的酸解试剂为TFA/DCM溶液；上述TFA/DCM溶液中TFA的体积占比为20
‑
80%，更优选地，TFA/DCM溶液中TFA的体积占比为40
‑
60%。
[0014]对本专利技术而言，上述磺酸化中用到的磺酸化试剂包含三氧化硫复合物；上述三氧化硫复合物选自三氧化硫/吡啶、三氧化硫/DMF或三氧化硫/三级胺复合物中的一种。
[0015]对本专利技术而言，上述三氧化硫/三级胺复合物选自三氧化硫/三甲胺复合物或三氧化硫/三乙胺复合物中的一种。
[0016]对本专利技术而言，上述三氧化硫复合物中三氧化硫的摩尔占比为45
‑
55%。
[0017]对本专利技术而言，上述氨解中用到的氨解试剂包含氨/DMF溶液；上述氨/DMF溶液中氨的浓度为10
‑
30wt%，更优选地，上述氨/DMF溶液中氨的浓度为15
‑
25wt%。
[0018]具体地，上述辛卡利特的固相合成方法，包括以下步骤：步骤一、在Fmoc
‑
Phe
‑
OH、碳酸铯中加入DMF（碳酸铯与DMF的质量体积比为1g:13
‑
20mL），搅拌0.8
‑
1.5h，然后加入到装有Merrifield Resin的固相反应器中，鼓氮气1.5
‑
2.5h，过滤，依次用DMF、DCM洗涤3
‑
5次，抽干，得到Fmoc
‑
Phe
‑
Resin；或，在固相反应器中加入Pam Resin，无水DMF（Pam Resin与无水DMF的质量体积比为1g:10
‑
20mL）溶胀树脂25
‑
35min，冷却至0
‑
2℃；然后将Fmoc
‑
Phe
‑
OH、DIC、DMAP依次加入到固相反应器中，鼓氮气反应2.5
‑
3.5h，过滤，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超滤柱，其特征在于：所述超滤柱包含下层和上层；所述超滤柱下层为硅胶，上层为改性聚苯乙烯；所述硅胶包含C18硅胶；所述改性聚苯乙烯由4,6
‑
二氨基
‑2‑
甲基巯基嘧啶胺基化改性聚苯乙烯而得。2.基于权利要求1所述超滤柱合成辛卡利特的方法，包括：步骤一、以Fmoc
‑
Phe
‑
OH作为首个氨基酸用于起始树脂的树脂加载；步骤二、采用固相Fmoc偶联法，将保护氨基酸逐步偶联获得肽树脂；步骤三、肽树脂经酸解、磺酸化、氨解后，获得辛卡利特粗品；步骤四、将辛卡利特粗品采用超滤柱纯化，获得辛卡利特纯品。3.根据权利要求2所述的基于超滤柱合成辛卡利特的方法，其特征在于：所述起始树脂选自Merrifield Resin或Pam Resin中的一种。4.根据权利要求2所述的基于超滤柱合成辛卡利特的方法，其特征在于：所述保护氨基酸包含：Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑
OH，Fmoc
‑
Met
‑
OH，Fmoc
‑
Tyr(...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪东亮，罗瑞昌，李雪豪，夏云超，
申请(专利权)人：杭州信海医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：