检测刺激隐核虫的RPA引物、试剂盒以及检测方法技术

本发明专利技术涉及检测刺激隐核虫的RPA引物、试剂盒以及检测方法，属于刺激隐核虫检测技术领域。本发明专利技术要解决的技术问题是提供检测刺激隐核虫的RPA引物、试剂盒以及检测方法。本发明专利技术的快速检测刺激隐核虫的RPA引物，具有特定的核苷酸序列。以样品总DNA为模板，利用该引物对进行RPA扩增，然后用琼脂凝胶电泳检测，若能检测出232bp的电泳条带，则判断为刺激隐核虫阳性，反之为阴性。本发明专利技术方法，其最低可检出的4个刺激隐核虫幼虫总DNA。本发明专利技术所述刺激隐核虫检测的方法操作简便、所需时间短(90分钟完成检测)、检测结果准确、特异性好、稳定性强、灵敏度高，适用于刺激隐核虫的快速检测和刺激隐核虫病的早期诊断。病的早期诊断。病的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
检测刺激隐核虫的RPA引物、试剂盒以及检测方法


[0001]本专利技术涉及检测刺激隐核虫的RPA引物、试剂盒以及检测方法，属于刺激隐核虫检测


技术介绍

[0002]刺激隐核虫是寄生在海水硬骨鱼身上的一种纤毛虫类原生动物，可引起宿主死亡的寄生虫病——刺激隐核虫病，由于其常引起病鱼的皮肤、鳃和鳍条处产生肉眼可见的小白点，故俗称“白点病”。刺激隐核虫对宿主鱼的种类和个体大小没有明显的选择性，可以感染几乎所有海水硬骨鱼类，寄生过程中会造成鱼体机械性损伤和引起器官功能障碍，机械性损伤易诱发病鱼继发性感染细菌性疾病，寄生于鳃部可导致病鱼呼吸困难、出现狂游、严重时窒息致死。2007～2010年期间刺激隐核虫病在福建宁德沙埕港、三都湾以及福州罗源湾连续暴发，发病率在30％～100％，经济损失达3亿，最严重的是在罗源湾，近4.3万口网箱内的所有养殖品种全部感染，死亡率达80％，经济损失超过了2亿元。2014～2015年期间海南养殖石斑鱼几乎全年都能检出刺激隐核虫滋养体，2014年琼海海欧村出现刺激隐核虫病爆发导致整池塘点带石斑鱼死亡情况，2015年万宁港北也出现了类似情况。2017年10月海南后水湾网箱内养殖的卵形鲳鲹全部感染刺激隐核虫，死亡率达90％以上，直接经济损失达1.5亿。刺激隐核虫给海水养殖行业造成巨大的经济损失。
[0003]目前刺激隐核虫病诊断方法主要包括传统临床诊断和镜检方法，其病原刺激隐核虫检测技术主要有传统的PCR技术和环介导等温扩增技术(LAMP)等。传统临床诊断是指通过鱼的活动情况观察和鱼外部检查进行诊断；而镜检是指取样病鱼病灶或鳃部，在显微镜下检测是否有刺激隐核虫滋养体。这些传统诊断方法虽然简单，但过于依赖经验、结果不准确、早期难以发现疾病等问题，只能作为初步的诊断。常规的PCR技术检测病原刺激隐核虫，虽能够准确检测出病原，但需要昂贵设备，且仅限于在实验室检测，无法现场实时检测。LAMP技术可在65℃恒温条件下1h内完成检测，对仪器设备要求相对较低，但其反应体系需要6条引物，且易出现假阳性。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年由英国公司开发的一种新型的等温扩增技术，其以重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶(Polynerase)为目标DNA片段扩增的三种核心酶，在37～39℃恒温条件下实现目标DNA片段的扩增，无需昂贵仪器设备、操作简单、用时短，结合试纸条等检测技术，可实现现场快速准确检测。此外，该检测方法非常灵敏，可在未出现典型体表病症之前准确诊断该病，在疾病大面积爆发之前进行防控，有效控制刺激隐核虫病的危害。也可以对养殖水体中的刺激隐核虫进行前期监控和检测，从而做到对刺激隐核虫前期感染风险的有效控制，具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服传统诊断和镜检技术经验依赖性强、结果不准确、初期诊断难等缺点，以及病原刺激隐核虫的传统PCR和LAMP检测法依赖昂贵仪器设备、
检测周期长、难以现场实时检测等缺点，提供一种用于检测刺激隐核虫的RPA引物、检测试剂盒以及检测方法。
[0005]本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种检测刺激隐核虫的RPA引物。
[0006]本专利技术检测刺激隐核虫的RPA引物的核苷酸序列如下：
[0007]正向引物FP的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物RP的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术解决的第二个技术问题是提供所述的检测刺激隐核虫的RPA引物在制备刺激隐核虫的检测试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术检测刺激隐核虫的RPA引物，可以用于制备刺激隐核虫的检测试剂盒中，快速、特异、灵敏且简单实用地检测刺激隐核虫。
[0010]本专利技术解决的第三个技术问题是提供刺激隐核虫的检测试剂盒。
[0011]本专利技术提供刺激隐核虫的检测试剂盒，包含上述的检测刺激隐核虫的RPA引物。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒还包括用于RPA反应的试剂。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述用于RPA反应的试剂包括：含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液、ddH2O和醋酸镁。
[0014]在本专利技术的一个具体实施方式中，含RPA冻干颗粒的反应管包括：噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链结合蛋白和dNTPS。
[0015]本专利技术还提供一种基于RPA技术检测水体中的刺激隐核虫的方法。
[0016]本专利技术基于RPA技术检测水体中的刺激隐核虫的方法，以待测样品提取的总DNA为模板，用上述的检测刺激隐核虫的RPA引物进行RPA反应，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若能检测出232bp的电泳条带，则判断为刺激隐核虫阳性，反之为阴性。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，在37℃恒温条件下RPA反应扩增至少30min。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，采用1％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方式中，RPA反应的扩增体系包括：含RPA冻干颗粒的反应管，29.4μL干粉溶解缓冲液、12.1μL dd H2O、2μL正向引物、2μL反向引物、2μL 78.25ng/μL DNA模板和2.5μL 280mM醋酸镁溶液。
[0020]与现有技术相比，本专利技术刺激隐核虫的RPA检测方法具有以下有益效果：
[0021]本专利技术建立了刺激隐核虫的RPA检测方法，可对刺激隐核虫进行定性检测。与其他技术相比，本方法不依赖于昂贵仪器设备，在37℃恒温设备甚至将样品握在手里维持稳定温度即可完成对目的基因的扩增，检测的方法操作简便、所需时间短(90分钟完成检测)、检测结果准确、特异性好、稳定性强、灵敏度高，适用于水体中刺激隐核虫的快速检测，具有较好的应用前景。
附图说明
[0022]图1为实施例1中RPA正向引物FP
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3筛选13条反向引物电泳结果示意图。其中泳道M为Maker DL2000；泳道1～13为13条反向引物，依次为RP
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1、RP
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2、RP
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3、RP
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4、RP
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5、RP
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8、RP
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9、RP
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14、RP
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15、RP
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16、RP
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17、RP
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19、RP
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20；泳道14为RPA检测试剂盒的阳性对照。
[0023]图2为实施例1中RPA反向引物RP
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14筛选11条正向引物电泳结果示意图。其中泳道M为Maker DL2000；泳道1～11为11条正向引物，依次为FP
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1、FP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测刺激隐核虫的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列如下：正向引物FP的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物RP的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。2.权利要求1所述的检测刺激隐核虫的RPA引物在制备刺激隐核虫的检测试剂盒中的应用。3.刺激隐核虫的检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的检测刺激隐核虫的RPA引物。4.根据权利要求3所述的刺激隐核虫的检测试剂盒，其特征在于：还包括用于RPA反应的试剂。5.根据权利要求3所述的刺激隐核虫的检测试剂盒，其特征在于：用于RPA反应的试剂包括：含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液、ddH2O和醋酸镁。6.根据权利要求5所述的刺激隐核虫的检测试剂盒，其特征在于：含RPA冻干颗粒的反应管包括：噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链结合蛋白和dNTPS。7.基于RPA技术检测水体...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永灿，郭伟良，宋玮玮，赵子晨，陈恩鹏，蒋满意，王世锋，孙云，邓恒为，张冬冬，李建龙，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：