一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测方法，属于基因检测技术领域。本发明专利技术涉及一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO：1～2所示。利用该引物对可以特异的检测得到不同品种羊在KAP8基因启动子区域的DNA甲基化水平。利用该区域的DNA甲基化水平可以判定绵羊羊毛纤维的粗细，为后期绵羊育种选育提供科学依据。为后期绵羊育种选育提供科学依据。为后期绵羊育种选育提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测的方法。

技术介绍

[0002]DNA作为储存生物信息的载体其含有A、G、C、T四种碱基，但这些碱基常常会伴随生物生长发育在调控基因功能方面发生一些化学修饰的变化，甲基化就是DNA天然修饰中最常见的一种形式。DNA甲基化在表观遗传调控中起着重要作用，是动物生长发育中一种常见的基因表达调控方式，这种变化通常发生在胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)密集处，也就是CpG岛。CpG岛多位于基因启动子区段，也是基因调控的关键区域，而CpG岛的甲基化修饰是影响基因转录表达的重要方式。研究证实，DNA甲基化通过改变基因上游启动子序列与转录因子的结合，从而调控基因表达，实现基因功能对表型的遗传控制，甚至DNA甲基化修饰能够决定物种性别。
[0003]羊毛生长发育是一个由多基因调控的复杂过程，羊毛主要成分由角蛋白关联蛋白(KAP)构成，且含量和结构组成对羊毛理化和表型特性具有重要影响，尤其KAP8的基因表达水平与羊毛细度高度相关。但是现有研究并未阐明KAP8基因如何调控绵羊的羊毛发育，更未公开如何通过DNA甲基化修饰调控绵羊羊毛发育的机制及其相应的检测方法。
[0004]基于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测的方法。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2所示。
[0008]本专利技术还提供了利用所述的引物对检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的方法，包括如下步骤：
[0009](1)提取离体绵羊皮肤组织的DNA，对所述的DNA进行甲基化处理，得到经过甲基化处理的待测基因组DNA；
[0010](2)以所述经过甲基化处理的待测基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增的产物，筛选阳性产物进行测序，测序结果进行比对，根据比对结果判断绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平。
[0011]作为优选，所述离体绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织和/或肩胛部皮肤组织。
[0012]作为优选，所述甲基化处理为亚硫酸氢盐甲基化处理。
[0013]作为优选，所述PCR扩增的条件为：
[0014]94℃预变性4.5～5.5min；94℃变性29～35s，退火58～65℃38～50s，34～40个循环；72℃延伸43～60s；之后72℃保持6.5～7.5min。
[0015]作为优选，所述PCR扩增产物的大小为193bp。
[0016]作为优选，步骤(2)所述检测为琼脂糖凝胶电泳检测；
[0017]所述琼脂糖凝胶电泳检测时的琼脂糖的初始浓度为1.5～2.5wt％。
[0018]作为优选，所述测序为双向测序或将阳性产物连接至空载载体中测序；
[0019]所述空载载体为pMD18
‑
T；
[0020]所述比对为利用Megalign软件进行比对。
[0021]本专利技术还提供了所述的引物对或所述的方法在判断绵羊品种或检测羊毛性状或选育绵羊品种中的应用。
[0022]作为优选，在判断绵羊品种或检测羊毛性状或选育绵羊品种时根据绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平进行；
[0023]当绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化修饰位点的数量>2时，判定为细毛羊品种；
[0024]当绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化修饰位点的数量≤1时，判定为粗毛羊品种；
[0025]当绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化修饰位点的数量＝2时，判定为介于细毛羊和粗毛羊之间的品种。
[0026]本专利技术提供了一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对及其应用与甲基化检测的方法。该方法具有以下优点：
[0027]本专利技术基于PCR和二代测序技术平台，对实验室设备和技术人员要求不高，适于大部分检测和研究单位应用。相对现有表型选育技术大大提高了检测效率和准确性，尤其对于成年后或后裔测定后才能开展的羊毛细度性状选育大大缩短了选育周期，加快了育种进程，对于细毛羊育种和品种鉴定都具有重要意义。
[0028]本专利技术人在前期试验的基础上，又开展了KAP8基因启动子区克隆和mRNA的全长克隆，发现了启动子区的基因多态性和品种特异性，并对此进行了甲基化CpG岛的预测，发现了中国美利奴细毛羊和萨福克羊以及中国美利奴细毛羊杂交后代DNA的差异，并对此开展了甲基化检测。检测结果证明，细毛羊的KAP8基因启动子有3个位点发生了甲基化修饰，而粗毛羊DNA中KAP8基因启动子仅有1个位点发生了甲基化修饰或没有甲基化，而细毛羊杂交后代KAP8基因启动子有2个位点发生了甲基化修饰。这一结果可以用于细毛羊的鉴定和对于羊毛细度的早期判定，能够用于分子标记辅助育种，加快育种进程。
附图说明
[0029]图1为KAP8上游分段扩增引物设计示意图。
[0030]图2为中国美利奴细毛羊的KAP8基因启动子区域中CpG富集情况图。
[0031]图3为KAP8基因启动子中潜在的甲基化位点(其中上行序列为原序列，下行序列为经过甲基化处理的序列)。
[0032]图4为甲基化特异性PCR扩增结果图(M表示Marker溶液，1～2表示萨福克粗毛羊，3～4表示中国美利奴细毛羊)。
[0033]图5为KAP8基因启动子区域测序峰图(A表示中国美利奴细毛羊，B表示萨福克粗毛羊)。
[0034]图6为KAP8基因启动子甲基化水平棒棒糖模型(行1～8表示KAP8基因启动子区预测的8个甲基化位点，列1～6中的列1～3为中国美利奴细毛羊阳性克隆，列4～6为萨福克羊阳性克隆，图中白点表示未发生甲基化，黑点表示发生甲基化修饰的GC位点)。
[0035]图7为三号甲基化位点转录因子预测结果图。
具体实施方式
[0036]本专利技术提供了一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2所示。
[0037]本专利技术还提供了利用所述的引物对检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的方法，包括如下步骤：
[0038](1)提取离体绵羊皮肤组织的DNA，对所述的DNA进行甲基化处理，得到经过甲基化处理的待测基因组DNA；
[0039](2)以所述经过甲基化处理的待测基因组DNA为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增的产物，筛选阳性产物进行测序，测序结果进行比对，根据比对结果判断绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平。
[0040]在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1～2所示。2.利用权利要求1所述的引物对检测绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取离体绵羊皮肤组织的DNA，对所述的DNA进行甲基化处理，得到经过甲基化处理的待测基因组DNA；(2)以所述经过甲基化处理的待测基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增的产物，筛选阳性产物进行测序，测序结果进行比对，根据比对结果判断绵羊KAP8基因启动子DNA甲基化水平。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离体绵羊皮肤组织为绵羊耳部皮肤组织和/或肩胛部皮肤组织。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲基化处理为亚硫酸氢盐甲基化处理。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性4.5～5.5min；94℃变性29～35s，退火58～65℃38～50s，34～40个循环；72℃延伸43～60s；之后72℃保持6.5～7.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：管峰，胡馨予，石国庆，万鹏程，唐红，代蓉，刘昱成，姜俊芳，蒋永清，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：