用于确定样本中预定的RNA序列的存在的等温实时PCR方法技术

本发明专利技术涉及一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加一种或多种提供RNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定样本中预定的RNA序列的存在的等温实时PCR方法
[0001]本专利技术涉及一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加一种或多种提供RNA
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和DNA
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依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；同时或之后向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育由前述步骤产生的样本；并且，确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，其中，所述样本中延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中预定的RNA序列的存在，其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
[0002]存在多种用于检测样本中RNA序列的存在的方法。然而，大多数已知的技术需要大量的时间。然而，在某些应用中，时间为限制因素。例如，野生动物群体中存在许多冠状病毒，但仅有少数发展出感染人类的能力，包括SARS
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CoV、MERS
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CoV以及新出现的SARS
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CoV
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2。它们都可以引起严重的呼吸的、胃肠的和中枢神经系统的疾病。
[0003]在许多情况下，冠状病毒感染未被患者识别或被识别为普通感冒。此外，冠状病毒在症状出现前的潜伏期(incubation time)为约4天至2周。这使得医疗保健系统跟踪病毒传播面临挑战。
[0004]此外，可用的分子病毒测试需要若干个小时以提供可靠的结果，并且必须在中央(centralized)实验室实施。在此期间，潜在感染者可能已经感染了其他人，从而进一步传播该病毒。
[0005]鉴于上述情况，迫切需要快速且可靠的检测方法用于确定样本中RNA的存在，特别是病毒RNA，更特别是来源于冠状病毒的RNA。
[0006]上述技术问题由本文所提供的并且如权利要求中所表征的实施方案解决。
[0007]因此，本专利技术涉及以下实施方案。
[0008]1.一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009](a)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加一种或多种提供RNA
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和DNA
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依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
[0010](b)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；
[0011](c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)产生的所述样本；
[0012](d)确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，
[0013]其中，所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的RNA序列的存在，
[0014]其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
[0015]2.根据实施方案1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(forward inner primer，FIP)、反向内引物(backward inner primer，BIP)、正向环引物(loop primer forward，LPF)和反向环引物(loop primer backward，LPB)。
[0016]3.根据实施方案1和2所述的方法，其中，所述第五种引物为B3引物。
[0017]4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶为逆转录酶或具有逆转录酶活性以及任选的链置换活性的DNA聚合酶。
[0018]5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中，RNA病毒为单链RNA病毒。
[0019]6.根据实施方案5所述的方法，其中，所述RNA病毒为冠状病毒。
[0020]7.根据实施方案6所述的方法，其中，所述冠状病毒(CoV)属于α
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CoV属、β
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CoV属、γ
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CoV属或δ
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CoV属。
[0021]8.根据实施方案6或7所述的方法，其中，所述冠状病毒选自由人类冠状病毒OC43(HCoV
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OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV
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HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV
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229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV
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NL63、纽黑文冠状病毒)、中东呼吸综合征相关的冠状病毒(MERS
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CoV或“新型冠状病毒2012”)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV或“SARS
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典型”)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2或“新型冠状病毒2019”)组成的组。
[0022]9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
[0023]10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
[0024]11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中，所述病毒为冠状病毒，所述引物中的一种或多种包括以下序列：
[0025](a)FIP引物序列：CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG；和/或
[0026](b)BIP引物序列：GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC；和/或
[0027](c)LPF引物序列：AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC；和/或
[0028](d)LPB引物序列：CAA ACT GTT GGT CAA CAA G；和/或
[0029](e)B3引物序列：GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG。
[0030]12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述延长的双链DNA序列可杂交的核酸分子以确定所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在，特别地其中所述核酸分子被标记，或通过使用嵌入所述延长的双链DNA序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在。
[0031]13.一种用于治疗患者的抗病毒化合物，其中，所述患者先前已通过使用根据实施方案6至12中任一项所述的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。
[0032]14.根据实施方案13所述的抗病毒化合物，其中，所述抗病毒化合物包括瑞德西韦(Remdesivir)。
[0033]因此，在第一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加一种或多种提供RNA
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依赖性和DNA
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依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；(b)在步骤(a)的同时或在步骤(a)之后，向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)产生的所述样本；(d)确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，其中，所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的RNA序列的存在，其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LPF)和反向环引物(LPB)。3.根据权利要求1和2所述的方法，其中，所述第五种引物为B3引物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶为逆转录酶和/或具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，RNA病毒为单链RNA病毒。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述RNA病毒为冠状病毒。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述冠状病毒属于α
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CoV属、β
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CoV属、γ
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CoV属或δ
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CoV属。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述冠状病毒选自由人类冠状病毒OC43(HCoV
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OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV
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HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV
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【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：恩德控股股份公司，
类型：发明
国别省市：