一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法技术

一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法，属于生物技术领域。该方法包括：选取金花茶绿叶及其枝条；将带有外源目的基因的质粒转化至农杆菌感受态细胞；挑取阳性农杆菌单克隆转入LB液体培养基中培养；侵染菌液侵染；荧光定量PCR验证目的基因的表达量情况。本发明专利技术的有益效果是：操作便捷，为金花茶基因功能验证提供新的技术手段，极大地提高效率，通过农杆菌瞬时转化金花茶离体叶片，将外源基因在金花茶叶片中成功表达，为更好地研究金花茶花色机理与开发利用奠定了基础。金花茶花色机理与开发利用奠定了基础。金花茶花色机理与开发利用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法。

技术介绍

[0002]金花茶(Camellia nitidissimaC.W.Chi)隶属于山茶科山茶属，其花色金黄、花瓣晶莹油润，深受人们喜爱，被誉为“茶族皇后”、“植物界的大熊猫”，是国家一级保护植物，并被例入植物保护红皮书。目前，山茶品种和物种已超过2万个，但其花瓣以红色系为主，黄花品种稀缺。金花茶在山茶中以其金黄花色著称，是进行黄花山茶育种和黄花形成机理研究的珍贵资源。不仅如此，金花茶还具有很高的医疗保健价值，因富含类黄酮等多种生物活性物质，能够起到抗肿瘤、抗氧化、防衰老、降血压降血脂等多种保健功效，2010年被正式批准为国家新资源食品，是一种新兴的药食兼用植物。因此，金花茶是集观赏、药用和食用于一体的珍贵物种，科研价值高、应用前景广。
[0003]然而，由于缺乏成熟的分子生物学研究体系，使得人们对金花茶的研究还不够深入，对其基因功能研究及分子育种进展十分缓慢，这对破解金花茶高类黄酮含量机理以及进一步的开发利用造成了极大的限制。因此，在金花茶中建立一种简单可行的基因功能验证方法具有很强的现实意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种利用农杆菌瞬时转化金花茶离体叶片进行基因表达的方法的技术方案，该方法操作简便，所需时间短，能够快速检测目的基因的表达及其功能，以解决转基因耗时长、基因功能分析不深入的问题。
[0005]本专利技术具体采用以下技术方案实现：
[0006]所述的一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法，其包括以下步骤：
[0007](1)选取金花茶植株上生长状况良好、无病虫害的绿叶及其枝条，将枝条放置于清水中备用；
[0008](2)将带有外源目的基因的质粒转化至农杆菌感受态细胞，所述农杆菌感受态细胞为GV3101农杆菌菌株，所述质粒为pCAMBIA1302植物过表达载体，于28℃恒温培养箱培养，挑取单克隆，经过聚合酶链式反应、电泳检测获得携带目的基因得阳性农杆菌；
[0009](3)挑取阳性农杆菌单克隆转入LB液体培养基中，并于摇床中过夜培养，OD
600
在0.8～1，将摇好的菌液进行常温离心，倒掉上清，收集菌体，使用侵染缓冲液进行重悬，获得侵染悬浮液，28℃静置3h；
[0010](4)选取步骤(1)中的金花茶叶片，用针筒式注射器的针头将叶片靠近叶脉处轻轻划出一道小口，随后去掉注射器的针头并吸取步骤(3)制备的侵染悬浮液，缓慢推动注射器活塞，使侵染菌液注射进入金花茶叶片中，随后将金花茶叶片在25℃黑暗条件下培养24h，
24h后将其转移到光照培养箱进行后续培养3～4天；
[0011](5)取下步骤(4)中离体培养后的金花茶叶片，液氮速冻并进行RNA提取、反转录得到cDNA，后续进行荧光定量PCR验证目的基因的表达量情况。
[0012]进一步，所述步骤(1)中叶片大小为5～20cm，枝条长度为15～20cm。
[0013]进一步，所述步骤(2)中外源目的基因为金花茶查尔酮合酶及查尔酮异构酶基因。
[0014]进一步，所述步骤(3)中LB液体培养基为带有卡那霉素抗性的LB液体培养基。
[0015]进一步，所述步骤(3)中离心条件为5000rpm、5min。
[0016]进一步，所述步骤(3)中所述侵染缓冲液具体包括10mM的2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸、10mM的氯化镁和100μM的乙酰丁香酮。
[0017]进一步，所述步骤(4)中光照培养箱培养条件为25
±
1℃，16h光照/8h黑暗，培养4～5天。
[0018]本专利技术的有益效果是：操作便捷，为金花茶基因功能验证提供新的技术手段，极大地提高效率，通过农杆菌瞬时转化金花茶离体叶片，将外源基因在金花茶叶片中成功表达，为更好地研究金花茶花色机理与开发利用奠定了基础。
附图说明
[0019]图1为本专利技术实施例中获取的阳性农杆菌。
[0020]图2为本专利技术实施例中选取的金花茶叶片及其枝条。
[0021]图3为本专利技术实施例中金花茶叶片瞬时转化操作图。
[0022]图4为本专利技术实施例中金花茶叶片瞬时转化后荧光定量PCR结果。
具体实施方式
[0023]以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术。
[0024]实施例1：阳性农杆菌的获取
[0025]将带有金花茶查尔酮合酶及查尔酮异构酶基因的载体pCAMBIA1302
‑
CnCHS、pCAMBIA1302
‑
CnCHI及pCAMBIA1302空载质粒使用冻融法转化农杆菌GV3101。转化过程为：(1)取3μl(约100
‑
200ng)质粒加入100μl感受态细胞中，冰浴25min左右；(2)转入液氮中，速冻5min；随后37℃水浴孵育5min；(3)加入600
‑
700μl LB液体培养基，置于28℃摇床，200rpm培养4
‑
6h；(4)室温5000rpm离心4min，弃大部分上清液，保留100μl培养液重悬沉淀；(5)将重悬液涂抹于LB固体平板上(含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，28℃培养36h；(6)挑取单克隆，进行菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示含有目的条带，表明成功获得携带目的质粒的阳性农杆菌。
[0026]实施例2：菌液的制备
[0027]将阳性单克隆菌落转移至5
‑
10mL含卡那霉素的LB液体培养基中，(10g/L的氯化钠，5g/L的酵母提取物，10g/L的胰蛋白胨，pH＝7.0)，并于摇床(28℃，200rpm/min)中过夜培养，将菌液分装到无菌离心管中，5000rpm离心5分钟，去上清，收集菌体，使用侵染悬浮液重悬菌体，其成分包含10mM的2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸、10mM的氯化镁、100μM的乙酰丁香酮，使其菌液在600nm波长下的光密度OD
600
为0.5左右，随后28℃避光静置2
‑
3小时。
[0028]实施例3：金花茶叶片侵染
[0029]选取金花茶植株上生长状况良好、无病虫害的绿叶及其枝条，将枝条放置于清水中备用，其中叶片大小为5～20cm，枝条长度为15～20cm，如图2所示。取金花茶叶片，先用一次性注射器针头轻轻划破金花茶叶片背部靠近叶脉处表皮，随后用一次性注射器吸取实施例2中的侵染悬浮液，去除注射器针头，将注射器抵在金花茶叶片背部划开的小口处，缓慢推动注射器活塞，使侵染悬浮液进入金花茶叶片中，同时在叶片的左右两端注释对照组及实验组菌液，以排除叶片生长状态不一对实验造成的干扰(图3)。注射完成后将金花茶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用农杆菌瞬时转化金花茶叶片进行基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)选取金花茶植株上生长状况良好、无病虫害的绿叶及其枝条，将枝条放置于清水中备用；(2)将带有外源目的基因的质粒转化至农杆菌感受态细胞，所述农杆菌感受态细胞为GV3101农杆菌菌株，所述质粒为pCAMBIA1302植物过表达载体，于28℃恒温培养箱培养，挑取单克隆，经过聚合酶链式反应、电泳检测获得携带目的基因得阳性农杆菌；(3)挑取阳性农杆菌单克隆转入LB液体培养基中，并于摇床中过夜培养，OD
600
在0.8～1，将摇好的菌液进行常温离心，倒掉上清，收集菌体，使用侵染缓冲液进行重悬，获得侵染悬浮液，28℃静置3h；(4)选取步骤(1)中的金花茶叶片，用针筒式注射器的针头将叶片靠近叶脉处轻轻划出一道小口，随后去掉注射器的针头并吸取步骤(3)制备的侵染悬浮液，缓慢推动注射器活塞，使侵染菌液注射进入金花茶叶片中，随后将金花茶叶片在25℃黑暗条件下培养24h，24h后将其转移到光照培养箱进行后续培养3～4天；(5)取下步骤(4)中离体培养后的金花茶叶片，液氮速冻并进行RNA提取、反转录得到cDNA，后续进行荧光定量PCR验证目的基因的表达量情况。2.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟鑫，余速航，李纪元，殷恒福，李辛雷，范正琪，王民炎，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：