一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物胺检测技术领域，提供了一种基于双酶

【技术实现步骤摘要】
一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物胺检测
，尤其涉及一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]食品中的生物胺因其安全隐患成为目前研究的热点。生物胺是一种在食品腐败过程中由于微生物活动或内源性组织代谢中发生的氨基酸脱羧而产生的碱性含氮化合物，特别是在水产食品因其自身的生化特性极易富集生物胺。因此，生物胺被认为是食品变质和安全的相关指标。此外，生物胺中的组胺、腐胺、尸胺等二胺类物质在过量摄入时会引起呕吐、呼吸紊乱、头痛，甚至中毒等症状。其中，组胺是毒性最强的二胺，在高摄入量时可能导致中毒。腐胺和尸胺可抑制与组胺相关的代谢酶的活性，并间接加重不适症状。因此，食品中二胺的检测不仅有利于其新鲜度的识别，对食品安全也有着重要意义。
[0003]目前，市面上常见的二胺检测方法有色谱法和毛细管电泳法，其中色谱法也是我国国家标准中规定的方法，这些检测方法虽已比较成熟，但在实际检测中普遍存在前处理复杂，成本高，操作复杂，需要昂贵的设备和熟练的人员等缺点。近年来，生物传感器因其快速、简便、特异等优势，逐渐被应用于生物胺检测。但生物传感器存在着活性和稳定性不易保持的问题，将会严重影响检测的精准度，因此，如何简便快捷地将生物传感器的优势最大化地运用到二胺含量检测中，可以成为研究的方向。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服现有技术中二胺检测方法存在的耗时久，成本高，需要昂贵仪器设备的缺陷，提供了一种用于检测食品中二胺含量的检测试剂盒，该检测试剂盒不需要昂贵的仪器和试剂，操作简便，灵敏度高且可视化。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术的第一个目的在于，提供了一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒，包括相互独立的R1试剂、R2试剂和R3试剂，所述R1试剂为二胺识别剂，所述R2试剂为显色剂，所述R3试剂为溶剂，所述二胺识别剂为辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球。
[0006]酶是生物传感器中最常用的生物识别元件，采用可以与二胺作用的酶对二胺进行检测，是相对于传统二胺检测技术的一个新的进步。但天然酶具有易失活、化学稳定性差等问题，因此，如何保证酶微球具有较高的活性和稳定性，提升检测的便捷性和效果，同时提升检测效率成为值得探索的问题。而采用生物矿化法制备无机杂化酶微粒可以有效解决上述问题，且该方法简单，所制得的酶微球具有较高的活性和稳定性，可用于检测实验中。辣根过氧化物酶（HRP）和二胺氧化酶（DAO）在二胺检测实验中扮演者重要角色，二胺氧化酶广
泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。二胺氧化酶催化二胺产生醛和过氧化氢，然后过氧化氢可与辣根过氧化物酶和显色剂作用，生成有色物质，通过进行吸光度的测定，即可获得样品中的二胺含量。
[0007]本专利技术采用生物矿化法同时对辣根过氧化物酶和二胺氧化酶进行固定，从而同时保证了两种酶可以具有较高的活性和稳定性，将制作好的辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球溶液作为二胺识别剂，将3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺（TMB）溶液作为显色剂，将超纯水、Tris
‑
HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种作为溶剂，做成试剂盒，然后采用这三种试剂对待测样品溶液进行检测，显色后根据溶液颜色变化或测吸光度，比照二胺含量之间的标准对应关系，得到待测样品的二胺含量。如此制作出来的二胺检测试剂盒，在能够准确检测如待测样品中二胺含量的同时，检测试剂还能够很好地得到保存，不容易因检测用的酶失活而导致检测试剂失效。
[0008]作为优选，所述显色剂为3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺，浓度为1～5 mM。
[0009]3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺（TMB）是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色产物通常可以在370nm或620
‑
652nm测定吸光度。本二胺检测试剂盒中的TMB显色剂浓度选择为1～5 mM，检测波长选择在652nm时检测效果最佳。
[0010]作为优选，所述溶剂为超纯水、Tris
‑
HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。
[0011]酶在水相溶剂体系中往往更稳定，且应当选择不会对实验的准确性产生干扰的水相溶剂，因此，这里将二胺检测试剂盒的溶剂优化为超纯水、Tris
‑
HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。
[0012]作为优选，所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球的制备过程为：（1）将CuSO4溶液加入到含辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置；（2）加入含二胺氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置，离心，得到所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球。
[0013]检测试剂盒中的识别剂的制备：将CuSO4溶液加入到含HRP的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.0~7.5）中，混合均匀，静置反应12小时。然后，加入含有 DAO的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.0~7.5），涡旋振荡混合均匀，再静置反应24小时。最后，将反应产物在离心机中离心以去除游离的酶，即得HRP/DAO
‑
Cu3(PO4)2杂化微球。
[0014]作为优选，所述辣根过氧化物酶的浓度为0.5～10 mg/mL，所述二胺氧化酶的浓度为0.5～10 mg/mL。
[0015]作为优选，所述辣根过氧化物酶与所述二胺氧化酶的加入浓度比为1:2～2:1。
[0016]经试验发现，当辣根过氧化物酶与所述二胺氧化酶的加入浓度比处于1:2～2:1范围内时，所制备的试剂盒的检测效果最佳。
[0017]本专利技术的第二个目的在于，提供了一种基于上述二胺检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：（1）利用二胺标准溶液，得到在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线；（2）将所述R1试剂加至所述R3试剂中，混合均匀后加入待测样品溶液，目标反应时间后得到中间产物溶液；
（3）向中间产物溶液中添加所述R2试剂继续反应，反应完成后，检测反应液在652 nm处的吸光度数值，并将其代入到标准曲线中，得到待测样品中的二胺浓度。
[0018]首先根据已知浓度梯度的二胺溶液在652 nm的吸光度数值，绘制得到二胺检测试剂盒在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线；将一定量的待测样品溶液添加至放有HRP/DAO
‑
Cu3(PO4)2溶液的样品管中，混合物振荡均匀后孵育10~45分钟后得到中间产物溶液；然后将一定量的TMB溶液加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间后通过溶液的颜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，包括相互独立的R1试剂、R2试剂和R3试剂，所述R1试剂为二胺识别剂，所述R2试剂为显色剂，所述R3试剂为溶剂，所述二胺识别剂为辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球。2.如权利要求1所述的一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺，浓度为1～5 mM。3.如权利要求1所述的一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述溶剂为超纯水、Tris
‑
HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。4.如权利要求1所述的一种基于双酶
‑
无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球的制备过程为：（1）将CuSO4溶液加入到含辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置；（2）加入含二胺氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置，离心，得到所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶
‑
磷酸铜杂化微球。5.如权利要求4所述的一种基于双酶
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彦波，刘亚楠，李欢，陈剑，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：