基于DNA-RNA杂合分子的纳米载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于纳米载体技术领域，涉及一种基于DNA

【技术实现步骤摘要】
基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体及其制备方法与应用

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[0001]本专利技术属于纳米载体
，涉及一种基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体及其制备方法与应用。

技术介绍
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[0002]卵巢癌(Ovarian cancer)作为一种妇科肿瘤，是常见严重危害女性生命健康的癌症之一，其发病率占女性癌症总比例的2.7％。卵巢癌常见于50
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70岁患者，但在青壮年患者中发病数量同样较多。卵巢癌的发生发展与遗传因素、环境因素等多种因素有关，但也与一些基因的表达密切相关。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)和RNA激活(RNA activation，RNAa)现象的发现，为基因表达调控提供了新方法，可以为开发卵巢癌的治疗带来新的策略。自发现siRNA、saRNA及miRNA等对细胞的目的基因存在明显调节作用以来，人们就开始了RNA药物的研发。逐渐地RNA药物显示出简单高效、靶点明确、低副作用的优点。然而，RNA药物的发展受到递送系统的限制，尤其商品化的siRNA和saRNA的递送系统存在靶向性差、细胞毒性强、过高的免疫原性、递送效率差等多方面问题。目前常用的RNA递送有脂质体法、抗体或配体化学偶联法等。因此，研发新的强靶向性、低细胞毒性、低免疫原性和成本低廉的递送系统，非常急需。
[0004]p21作为一种抑癌基因，是细胞周期依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员之一。p21参与细胞周期调节，为重要的细胞周期调节因子，参与细胞内DNA的复制及修复过程，与p53基因共同作用组成细胞周期的G1期检查点，阻止癌症的发生发展。因此，p21基因在细胞增殖中发挥着非常重要的作用，其活性的异常变化常常与癌症等多种疾病有关。
[0005]在T淋巴细胞表面，存在许多重要的功能调控分子，他们对T细胞的活化、增殖和发挥抗肿瘤效应具有非常重要意义。相对目前熟悉的VTCN1(V
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set domain containing T cell activation inhibitor 1)、PD
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L1(Programmed cell death 1ligand 1)、CTLA
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4(Cytotoxic T
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lymphocyte associated protein 4)、LAG
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3(Lymphocyte activating 3)、HAVCR2(Hepatitis A virus cellular receptor 2)、CD160、CD244等免疫检查点而言，TIGIT也是细胞表面蛋白，作为免疫球蛋白超家族中的一员，TIGIT具有显著的免疫抑制功能，其全名为具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)。TIGIT是一种抑制性受体，在多种免疫细胞上表达，包括活化的CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)等。除此之外，TIGIT在调节性T细胞抑制性免疫细胞上表达较多，并参与行使其免疫抑制功能，帮助肿瘤免疫抑制微环境的形成。
[0006]核酸适配体是利用体外筛选技术，即指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，筛选寡核苷酸分子用于靶向目标蛋白或化合物。核酸适配体在功能上与抗体类似，具特异靶向性，一般为寡核苷酸序列。核酸适配体具有分子量小、无免疫原性、易于进行修饰等优点，常常用于靶向生物检测
或传感器的制备。各种类型的核酸适配体中，AS1411核酸适配体是由Bates等人在1999年报道的，可有效靶向核仁素(Nucleolin,NCL)，又称为核仁蛋白或C23蛋白。核仁素是一个110kDa磷酸化蛋白，其功能与核糖体的生命活动密切相关，包括rRNA的转录调节等。近年来研究表明，核仁素作为一种跨膜蛋白，大部分分布于强增殖能力或低分化肿瘤细胞膜上，在肿瘤细胞表面呈现大量表达。所以，结合核仁素的适配体AS1411可广泛应用于肿瘤细胞的成像等，也可应用于肿瘤的治疗。但是，目前还未见有报道以适配体为靶向工具的DNA
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RNA杂合纳米载体，完成核酸药物的靶向递送。

技术实现思路
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[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体制备方法与应用。该载体以AS1411适配体为导向，靶向肿瘤细胞表面的核仁蛋白，并连接目的小RNA核酸药物，在细胞的内吞作用下把纳米载体摄入细胞，完成核酸药物的靶向和胞内递送，为传统的小核酸药物的靶向递送提供新的低毒性方案。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体，包括DNA
‑
RNA杂交分子、AS1411适配体和小RNA核酸药物(或目的RNA)，DNA
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RNA杂交分子是AS1411适配体和目的RNA的连接桥梁；目的RNA分子共价键与DNA
‑
RNA杂交分子中的RNA
‑3′
连接。
[0009]所述DNA
‑
RNA杂交分子的DNA链3
′
端连接AS1411适配体的5
′
端。
[0010]所述AS1411适配体的序列，参考文献报道如SEQ ID NO：1所示；所述DNA
‑
RNA杂交分子的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，RNA序列如SEQ ID NO：3的5
′
端16个碱基。
[0011]所述目的RNA的碱基U和C为2
′‑
氟代修饰，即UTP和CTP的2号位的
‑
OH替换为
‑
F。
[0012]所述目的RNA为p21基因saRNA或TIGIT基因siRNA。
[0013]所述p21基因saRNA的序列，参考文献报道如SEQ ID NO：3的3
′
端21个碱基和SEQ ID NO：4所示；TIGIT基因siRNA的序列如SEQ ID NO：5的3
′
端23个碱基和SEQ ID NO：6所示。
[0014]本专利技术还提供所述基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体的制备方法，首先合成所需的目的RNA和DNA
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RNA杂交分子
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AS1411适配体，并对目的RNA的CTP和UTP进行2
′‑
氟代化学修饰；将DNA
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RNA杂交分子
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AS1411适配体与相应的目的RNA等摩尔混合制成溶液，与等体积杂交缓冲液(2xPBS<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体，其特征在于，包括DNA
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RNA杂交分子、AS1411适配体和目的RNA，DNA
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RNA杂交分子是AS1411适配体和目的RNA的连接桥梁；AS1411适配体共价键与DNA
‑
RNA杂交分子中的DNA
‑3′
连接，目的RNA分子共价键与DNA
‑
RNA杂交分子中的RNA
‑3′
连接。2.根据权利要求1所述基于DNA
‑
RNA杂合分子的纳米载体，其特征在于，所述DNA
‑
RNA杂交分子的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的5
′
端16个碱基所示。3.根据权利要求1所述基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体，其特征在于，所述目的RNA的碱基U和C为2
′‑
氟代修饰。4.根据权利要求1所述基于DNA
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RNA杂合分子的纳米载体，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛科立，赵昌麒，葛银林，杨柳，白佳瑶，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：