一种靶向GD2球形核酸纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向GD2球形核酸纳米粒及其制备方法和应用，该制备方法包括：采用siRNA核酸链、核酸适配子核酸链和小分子抑制剂NVP

【技术实现步骤摘要】
一种靶向GD2球形核酸纳米粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种靶向GD2球形核酸纳米粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]罕见病视网膜母细胞瘤(RB)是儿童最常见的一种眼内恶性肿瘤。RB的诊断主要依靠影像学检查和眼科特检，近些年来随着基因检测的广泛应用，基因检测成为临床医生诊断RB的新的方法。传统的RB的治疗方法主要包括手术(眼球摘除手术)、化学治疗、放射治疗、局部治疗等，近年来，基因治疗、玻璃体手术治疗也开始应用。
[0003]p53为一抑癌基因，位于染色体17p13
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17上编码分子量为53KD的核内磷蛋白。该蛋白参与DNA复制、修复过程并且具有转录调节因子的作用还可根据需要诱导凋亡。MDM2是一种癌基因在许多肿瘤尤其是肉瘤等恶性肿瘤中都有MDM2的扩增MDM2癌基因定位于12q13
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14，多项实验证实了该基因能使体外细胞发生转化并具有动物成瘤性。现已研究表明MDM2是通过与p53结合在肿瘤中起作用的。因此降低MDM2的活性，阻断p53
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MDM2相互作用，从而抑制RB的增殖、侵袭与迁移。
[0004]研究发现，Rb基因功能丧失引起的细胞凋亡可由p53介导。p53在转录水平激活WAF1(一种与p53相关的细胞周期循环基因)表达从而抑制细胞周期循环认为p53基因对视网膜母细胞瘤起一个管理作用。MDM2(鼠双微粒体2)对人类肿瘤有扩增和过度表达这表明它对肿瘤的形成和发展起促进作用。
[0005]MDM2有多种功能其中主要的功能是与野生型或突变型p53蛋白的相互作用。MDM2能在野生型p53基因的诱导下转录增强致使MDM2蛋白水平升高。反过来MDM2蛋白与p53结合形成复合物促进p53蛋白的降解抑制其功能的发挥。因此p53与MDM2构成了自反馈调节环。通过这种调节p53与MDM2在细胞内能处于平衡状态这即利于DNA损伤后的修复，同时又防止修复后细胞生长受阻。而这种平衡的维持和调节取决于p53与MDM2蛋白的存在方式(游离和结合状态)和数量。当MDM2蛋白过度表达时将阻断p53蛋白的转录激活，从而抑制后者功能的发挥这与p53突变产生的作用相似。另外MDM2还可以与p53突变蛋白结合这种结合对后者具有稳定作用并且某些p53突变蛋白也可能激活或增强MDM2基因的表达或MDM2蛋白的功能。有资料显示p53突变蛋白呈阳性表达的细胞有更大的成瘤性，MDM2还可通过p53非依赖性方式在肿瘤的发生、发展中起作用。最近新的研究表明MDM2和p53的调节通路有新的酶化途径参与，这表明两者之间的作用不是单一途径。研究表明视网膜母细胞瘤的发生、发展是多个癌基因和抑癌基因异常改变的结果，尤其是MDM2基因的扩增或过表达及p53基因突变在其中起着举足轻重的作用。
[0006]神经节苷GD2是一种广泛存在于人类癌症和干细胞中的肿瘤相关表面抗原，在包括儿童胚胎肿瘤(神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等)中异常表达，因而GD2已被证明是安全的抗体靶向。
[0007]迄今为止，少有针对RB生物靶向疗法的研究与报道，面对我国RB的治疗现状，同时
响应全球“个体化治疗”和“精准治疗”策略的呼吁，研发出高效低毒的特异性靶向药物已成为临床治疗RB、挽救患者眼球甚至生命亟待解决的关键问题。

技术实现思路

[0008]针对以上技术问题，本专利技术公开了一种靶向GD2球形核酸纳米粒及其制备方法和应用，可有效抑制RB细胞的生长，可用于制备高效低毒的特异性靶向药物中。
[0009]对此，本专利技术采用的技术方案为：
[0010]一种靶向GD2球形核酸纳米粒的制备方法，包括：
[0011]利用核酸亲水性和胆固醇亲脂性的特性，采用siRNA核酸链、核酸适配子核酸链和小分子抑制剂NVP
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CGM097自组装得到球形核酸纳米粒S
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AGsM7；其中，所述siRNA核酸链的正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述核酸适配子核酸链的序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
[0012]正义链：
[0013]5‑
CCACCUCACAGAUUCCAGC(dT)(dT)(dT)(dT)(dA)(dG)(dC)(dT)(dT)(dG)(dC)(dA)(dG)(dT)(dC)(dC)(dT)
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3(SEQ ID NO.1)；
[0014]反义链：5
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GCUGGAAUCUGUGAGGUGGTT
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3(SEQ ID NO.2)；
[0015]核酸适配子核酸链：
[0016]5‑
AGGACTGCAAGCTAACCGCCCAAATCCCTAAGAGCACAAACACCAAACACAACCACCCCAACCAGACACACTACACACGCA
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3(SEQ ID NO.3)；
[0017]所述正义链的3'端通过硫醚键与胆固醇连接，所述核酸适配子核酸链的5'端通过硫醚键与胆固醇连接。
[0018]此技术方案得到的靶向GD2球形核酸纳米粒，可以采用SNA技术精准阻断MDM2
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p53通路，在基因水平与蛋白水平双靶向精准抑制RB增殖，即利用核酸亲水与胆固醇亲脂的特点，将包含干扰MDM2蛋白表达的干扰RNA(siRNA)的核酸链3'端修饰胆固醇，将包含靶向GD2的核酸适配子的核酸链5'端修饰胆固醇，两条核酸链与阻断MDM2
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p53的小分子抑制剂NVP
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CGM097混合，通过亲水亲脂性与核酸碱基互补配对特性，自组装成球心负载NVP
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CGM097的球形核酸SNA。该球形核酸SNA可通过核酸适配子特异性结合细胞表面GD2，将siRNA
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MDM2和NVP
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CGM097精准递送并摄取至靶细胞，在还原型谷胱甘肽(GSH)作用下降解每条核酸链的二硫键，释放siRNA
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MDM2和NVP
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CGM097，一方面siRNA
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MDM2干扰MDM2的表达，另一方面NVP
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CGM097与p53竞争性结合MDM2，阻断MDM2
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p53的相互作用，抑制p53的降解，从而抑制RB增殖。
[0019]作为本专利技术的进一步改进，所述siRNA核酸链、核酸适配子核酸链的物质的量之比为1:1，所述小分子抑制剂NVP
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CGM097与siRNA核酸链/核酸适配子核酸链的物质的量之比为5
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15:1。进一步优选的，所述小分子抑制剂NVP
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CGM097与siRNA核酸链/核酸适配子核酸链的物质的量之比为10:1。采用此技术方案，小分子抑制剂NVP
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CGM097与siRNA核酸链/核酸适配子核酸链的物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向GD2球形核酸纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：采用siRNA核酸链、核酸适配子核酸链和小分子抑制剂NVP
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CGM097自组装得到球形核酸纳米粒S
‑
AGsM7；其中，所述siRNA核酸链的正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述核酸适配子核酸链的序列如SEQ ID NO.3所示；所述正义链的3' 端通过硫醚键与胆固醇连接，所述核酸适配子核酸链的5' 端通过硫醚键与胆固醇连接。2.根据权利要求1所述的靶向GD2球形核酸纳米粒的制备方法，其特征在于：所述siRNA核酸链、核酸适配子核酸链的物质的量之比为1:1，所述小分子抑制剂NVP
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CGM097与siRNA核酸链/核酸适配子核酸链的物质的量之比为10:1。3.根据权利要求2所述的靶向GD2球形核酸纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：步骤S1，制备siRNA核酸链冻干粉末和核酸适配子核酸链冻干粉末；步骤S2，将siRNA核酸链冻干粉末和核酸适配子核酸链冻干粉末分别用无RNase水溶解得到siRNA核酸链溶液和核酸适配子核酸链溶液，将NVP
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CGM097加入有机溶剂中溶解，得到NVP
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CGM097溶液，将siRNA核酸链溶液、核酸适配子核酸链溶液、NVP
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CGM0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张少冲，马岚，王世静，
申请(专利权)人：深圳市眼科医院，
类型：发明
国别省市：