一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用，包括微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；捕获探针序列为D

【技术实现步骤摘要】
一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用。

技术介绍

[0002]肝纤维化是由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酗酒、代谢综合征等各种致病因子导致肝内结缔组织异常增生的病理状况。任何肝脏损伤在修复愈合的过程中都有肝纤维化的发生，如果纤维化的过程长期持续，会最终导致肝硬化。因此，肝纤维化是预测慢性肝脏损伤和疾病进展的重要因素，对肝纤维化及时进行诊断至关重要。目前肝纤维化的诊断方法主要包括肝穿刺活组织检查和血清分子标志物检测。血清分子标志物检测作为一种无损检测方法，成本低、简单方便，因此在肝纤维化的诊断领域备受关注。
[0003]胶原蛋白是肝纤维化血清分子检测的重要生物标志物。专利技术专利CN105911296A公开了一种IV型胶原蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法；专利技术专利WO2021193763A1公开了一种IV型胶原7S域片段的测定方法及其使用试剂盒。这些专利提供了单一组分IV型胶原蛋白的荧光检测方法，但是肝纤维化是多种类型胶原蛋白共同作用的结果，开发更加高效的、同时检测血液中不同类型胶原蛋白的方法，仍然是巨大挑战。
[0004]光固化3D打印是一种新型的自由形式制造技术，采用数字控制的逐层沉积方案来生产复杂的组件和架构材料。该技术从计算机辅助设计(CAD)开始设计3D模型，由专用程序切片并以多层切片方式提供给3D打印机。光固化技术具有模型可定制、选择精度高、聚合速度快，打印速度快的优点。3D打印应用于生物检测中，可实现多种功能成分均匀、牢固地分布于芯片中。
[0005]专利技术人在研究过程中意外的发现，一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒及其在肝纤维化诊断中的应用，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；捕获探针序列为D
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(Gly
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Pro
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Hyp)n
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Ahx
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Cys
‑
X或D
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(Gly
‑
Pro
‑
Pro)n
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Ahx
‑
Cys
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X，n为8
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20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y
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CTP
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X
‑
R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y
‑
CTP为不同类型胶原蛋白靶向探针；所述试剂盒操作简单方便，可以同时检测溶液中的多种胶原蛋白标志物，特异性高，检测限低，可用于肝纤维化的无损早期诊断，具有广泛的应用前景。

技术实现思路

[0006]针对上述技术问题，本专利技术提供了一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与胶原蛋白捕获探针混合，光固化3D打印得到；所述捕获探针序列为D
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(Gly
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Pro
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Hyp)n
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Ahx
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Cys
‑
X或D
‑
(Gly
‑
Pro
‑
Pro)n
‑
Ahx
‑
Cys
‑
X，n为8
‑
20之间的整数，其中X
为纳米粒子；所述检测探针序列为Y
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CTP
‑
X
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R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y
‑
CTP为不同类型胶原蛋白的靶向探针。
[0007]优选的，Y为I型，II型，Ⅲ型或IV型胶原蛋白。
[0008]优选的，X为过渡金属纳米粒子和/或半导体纳米粒子中。
[0009]优选的，X为Au、Ag或Cu纳米粒子。
[0010]优选的，所述PEGDA溶液的活化方法为：取PEGDA，加入0.1％wt光引发剂苯基双(2，4，6
‑
三甲基苯甲酰基)氧化膦，搅拌至均一溶液。
[0011]优选的，所述的光固化打印参数为：层高25μm，基层层数5，基层曝光2.1s，片层层数90，片层曝光2.1s，光强2mW/cm2。
[0012]优选的，所述拉曼信号分子选自4
‑
MBA、4
‑
MBN、4
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EBT、S
‑
(4
‑
乙炔基苯基)乙硫代酸酯、S
‑
(4
‑
((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯和S
‑
(4
‑
氰基苯基)乙硫代酸酯中任一种。
[0013]优选的，所述的捕获探针序列通过固相合成法制备。
[0014]优选的，所述的固相合成法包括如下步骤：
[0015]a.将80
‑
120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2
‑
8mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0016]b.由15
‑
25％哌啶/N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
[0017]c.将4eq N端由Fmoc保护的氨基酸、4eq HOBt和4eq HBTU由DMF溶解，低温活化10
‑
30min后，向溶液中滴加6eq DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1
‑
6hrs；
[0018]d.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2
‑
8mLDMF和DCM洗2
‑
4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15
‑
25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0019]e.之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20
‑
30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3
‑
8mLDMF和DCM洗2
‑
4次；
[0020]f.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2
‑
4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1
‑
6hrs；
[0021]g.向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2
‑
4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向检测溶液中胶原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括3D打印的微针芯片、固定于微针芯片上的捕获探针和游离的检测探针；所述微针芯片由活化的PEGDA溶液与捕获探针混合，光固化打印得到；所述捕获探针序列为D
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(Gly
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Pro
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Hyp)n
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Ahx
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Cys
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X或D
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(Gly
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Pro
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Pro)n
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Ahx
‑
Cys
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X，n为8
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20之间的整数，其中X为纳米粒子；所述检测探针序列为Y
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CTP
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X
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R，X为纳米粒子，R为拉曼信号分子，Y
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CTP为不同类型胶原蛋白的靶向探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，X为过渡金属纳米粒子和/或半导体纳米粒子。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，X为Au、Ag或Cu纳米粒子。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEGDA溶液的活化方法为：取PEGDA，加入0.1％wt光引发剂苯基双(2，4，6
‑
三甲基苯甲酰基)氧化膦，搅拌至均一溶液。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，粘琳格，刘鹏，
申请(专利权)人：兰州生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：