一种研究果实蛋白质N-糖基化的整合分析方法技术

本发明专利技术提供了一种研究果实蛋白质N

【技术实现步骤摘要】
一种研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质N
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糖基化分析领域，具体涉及果实蛋白质N
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糖基化的整合分析策略在差异N
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糖基化蛋白对于果实成熟等生理功能调控的应用。

技术介绍

[0002]桃(Prunus persica(L.)Batsch)属于蔷薇科李属植物，具有重要的经济价值。在植物中，果实成熟是一个复杂的生理过程，包括果实硬度变化、果实中碳水化合物的分解合成、色泽香气变化等。基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等现代组学方法促进了人们对桃果实成熟内在机理的相关研究(Garcia Gomez等，2020)。
[0003]成熟过程中植物细胞壁的动态变化与细胞中具有催化活性的酶、细胞壁中的糖和糖基化蛋白中聚糖的作用相关。其中，糖基化影响蛋白质折叠、溶解度、稳定性等理化性质，参与多种植物生理代谢过程，与植物细胞壁代谢息息相关。蛋白质N
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糖基化是一种在内质网、高尔基体中通过多种聚糖加工酶对N
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糖链修剪产生不同N
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糖基化蛋白的一种重要翻译后修饰，能维持蛋白质的稳定折叠，在植物生长发育中发挥重要作用。此外，蛋白质N
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糖基化在调节内质网质量控制(ERQC)、胁迫响应和信号转导方面发挥着功能作用。N
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糖基化蛋白组的特征对于理解植物生长发育过程的N
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糖链分布、结构拓扑、细胞位置和分子适应具有特别重要的意义(Rayon C等，1998年)。
[0004]植物N
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糖链的生物合成过程始于寡糖基转移酶(OST)将一种低聚糖转移到内质网中新生蛋白质的结构基序Asn
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X
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Ser/Thr(X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)。端糖和甘露糖被甘露糖苷酶(MNSs)依次修剪，以生成高甘露糖类型的N
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糖链(Man5‑9GlcNAc2)。ERQC通过钙联接蛋白和钙网蛋白将N
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糖基化蛋白与内质网伴侣结合，识别未折叠或错误折叠的蛋白质。错误折叠蛋白随后被靶向并移位，用于内质网相关降解(ERAD)(Song W，2011年)。正确折叠的糖基化蛋白被运输到高尔基体、质膜和其他亚细胞器，在N
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乙酰氨基葡糖转移酶(GNT1)、岩藻糖苷转移酶(α
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1,3
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FucT)和木糖基转移酶(β
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1,2
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XylT)的作用下添加N
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乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖和木糖，在成熟蛋白质中形成复合、杂交和寡甘露糖型N
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糖链(Helenius A，2004)。在内质网中，甘露糖型N
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糖链可能有助于蛋白质折叠过程。糖基化过程中聚糖可用作标志物以反映蛋白质折叠状态。
[0005]N
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糖基化过程对果实成熟软化有重要调控作用。研究表明多种N
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糖基化蛋白加工酶，在植物果实成熟中发挥重要作用。β
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D
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N
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乙酰基己糖胺酶(β
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Hex)活性随着果实软化而增加，促进果实成熟(Cao，2014)。糖基化水解酶/糖苷转移酶FcXTH1和膨胀蛋白之间可能会发生协同催化作用，从番茄绿熟期到红熟期过程中改变纤维素木葡聚糖网络，促进果实软化(Angela Mendez
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Yanez，2017)。也有研究表明降低N
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乙酰氨基葡萄糖基转移酶I(GNTI)的活性后，发现果实早期脱落、出现不完全成熟等现象(Kaulf
ü
rst
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Soboll，2021)。但由于植物中糖类相对含量较低和N
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糖基化蛋白的结构异质性，N
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糖基化在翻译后修饰过程中的具体作用以及蛋白N
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糖基化如何影响并调控果实发育成熟至今仍不清楚(Ruiz May，2012)。
[0006]针对以上问题，设计和开发基于果实蛋白质N
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糖基化的整合分析策略对于果实成熟软化等生理功能研究具有重要的借鉴和意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术以不同成熟度桃果实为研究对象，分别将未成熟(IF)和成熟(MF)设为对照组和处理组。提取桃果实N
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糖链和N
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糖肽，通过集成反应性基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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TOF)和稳定同位素标记结合纳米液相色谱
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电喷雾电离串联质谱(nLC
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ESI
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MS/MS)进行分析和检测。在MALDI靶板上衍生N
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糖链，采用DHBH作为衍生型基质对N
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糖链进行定性和定量评价。其次，对含有
18
O标记的N
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糖基化位点的N
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糖肽进行鉴定和定量分析。结合N
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糖组和N
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糖基化蛋白组，通过生物信息学方法挖掘N
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糖基化水平上差异表达的N
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糖基化蛋白(DEGPs)的潜在功能。有助于理解果实成熟过程中N
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糖基化的潜在调控作用。通过将N
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糖基化蛋白组数据与来自同一样品的蛋白质组数据整合来确定MF/IF中N
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糖基基化位点占有率的变化，并进一步对N
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糖基化蛋白的糖基化位点有无情况进行成熟关联分析，确定了几个重要N
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糖基化蛋白作为桃成熟过程中潜在N
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糖基化调控靶点。
[0008]桃果实成熟过程对蛋白质的N
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糖基化修饰进行定性定量检测分析的策略，一种研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009](1)桃果实样品的前处理；
[0010](2)对前处理后的桃果实样品进行蛋白提取，获得总蛋白；
[0011](3)N
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糖链的制备；
[0012](4)总肽、N
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糖肽的制备；
[0013](5)N
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糖链糖型测定和动态变化分析；
[0014](6)N
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糖肽糖基化位点测定和动态变化分析；
[0015](7)蛋白组的测定；
[0016](8)结合N
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糖基化蛋白组数据和蛋白组数据分析糖基化位点占有率；
[0017](9)差异表达的糖基化位点占有率分析；
[0018](10)GO功能注释和KEGG富集分析；
[0019](11)成熟相关潜在靶标糖基化蛋白的动态变化规律。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)桃果实样品的前处理；(2)对前处理后的桃果实样品进行蛋白提取，获得总蛋白；(3)N
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糖链的制备；(4)总肽及N
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糖肽的制备；(5)N
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糖组中N
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糖链糖型测定和动态变化分析；(6)N
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糖基化蛋白组中N
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糖肽糖基化位点测定和动态变化分析；(7)蛋白组中总肽的测定；(8)结合N
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糖基化蛋白组数据和蛋白组数据分析糖基化位点占有率；(9)差异表达的糖基化位点占有率分析；(10)GO功能注释和KEGG富集分析；(11)成熟相关潜在靶标糖基化蛋白的动态变化规律。2.根据权利要求1所述的研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，步骤(1)中，桃果实样品的前处理具体包括：将桃果实在液氮中冷冻后研磨成粉末，然后储存在
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70℃至
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90℃。3.根据权利要求1所述的研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，步骤(2)中，对前处理后的桃果实样品进行蛋白提取，获得总蛋白，具体包括：称取前处理后的桃果实样品、使用缓冲液提取样品中总蛋白、加热失活、蛋白过夜沉淀后使用甲醇和丙酮依次清洗，获得总蛋白。4.根据权利要求1所述的研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，步骤(3)中，N
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糖链的制备，具体包括：将步骤(2)获得的总蛋白溶解在Tris
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HCl中，加热使蛋白质变性，添加胰蛋白酶、糜蛋白酶和CaCl2，于36～38℃下孵育过夜进行蛋白酶解，再次加热将反应混合物中酶失活并用柠檬酸盐磷酸盐缓冲液将溶液pH调至3.5～4.5。添加PNGase A在36～38℃下孵育过夜，将上清液加入C18固相萃取柱去除蛋白质、多肽杂质，然后进行固相萃取柱纯化去杂质，用乙腈洗脱N
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糖链并收集，真空干燥，得到N
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糖链。5.根据权利要求1所述的研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，步骤(4)中，总肽及N
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糖肽的制备，具体包括：将步骤(2)获得的总蛋白溶解在pH 7～9的尿素/NH4HCO3缓冲液中，在36～38℃下用二硫苏糖醇还原，并在黑暗中用碘乙酰胺烷基化，用NH4HCO3缓冲液将混合物稀释至0.8～1.2M尿素，并在36～38℃以酶与蛋白质之质量比为0.5～1.5:100进行胰蛋白酶消化16～20h，使用HLB固相萃取柱脱盐，然后在真空下干燥，将获得的肽溶解在HILIC柱的平衡缓冲液中，获得总肽；将使用HLB固相萃取柱脱盐后获得的上清液转移至HILIC固相萃取柱后，离心，洗脱N
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糖肽，缓冲液洗涤HILIC固相萃取柱，收集洗脱液，真空干燥，用溶解于柠檬酸盐磷酸盐缓冲液的PNGase A去除N
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糖链，C18固相萃取柱进一步纯化得到N
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糖肽。6.根据权利要求1所述的研究果实蛋白质N
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糖基化的整合分析方法，其特征在于，步骤(5)中，N
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糖组中N
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糖链糖型测定和动态变化分析，具体包括：采用步骤(3)获得的N
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【专利技术属性】
技术研发人员：李鲜，赵晓勇，王嘉祺，徐昌杰，张波，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：