寡核苷酸氨解方法技术

本申请涉及一种寡核苷酸氨解方法，该方法包括以下步骤：向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；洗脱处理的时间为30min～120min，洗脱处理的温度为18℃～28℃；将第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；其中，第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。上述寡核苷酸氨解方法中，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。的寡核苷酸产品。的寡核苷酸产品。

【技术实现步骤摘要】
寡核苷酸氨解方法


[0001]本申请涉及寡核苷酸
，特别涉及到一种寡核苷酸氨解方法。

技术介绍

[0002]寡核苷酸，又称短链核苷酸，包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对连结，所以常用来作为引物或探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。引物(primer)是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点。目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行，固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点；该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5
→
3方向延伸，而是由3
’
端开始的，相邻的核苷酸通过3
→
5磷酸二酯键连接。TaqMan
TM
TAMRA
TM
探针是以Tamra为固相载体合成的一小段单链DNA或RNA。
[0003]氨解反应是指含有各种保护官能团的单体在高温氨气水溶液的作用下脱保护生成游离引物或探针的过程，保护官能团即碱基环上的氧乙基、苯甲酰基、异丙基等保护基团。但是采用传统的氨解方法进行氨解，寡核苷酸的结构尤其是Tamra结构会有所降解，产物纯度和产量降低，导致最终得率只有10％～20％。

技术实现思路

[0004]基于此，本申请提供了一种降解较少、得率较高的寡核苷酸氨解方法。r/>[0005]本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]本申请提供一种寡核苷酸氨解方法，包括以下步骤：
[0007]向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；所述洗脱处理的时间为30min～120min，所述洗脱处理的温度为18℃～28℃；
[0008]将所述第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；
[0009]其中，所述第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。
[0010]在其中一个实施例中，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1)：(1～4)。
[0011]在其中一个实施例中，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：1：2。
[0012]在其中一个实施例中，所述洗脱处理的时间为45min～90min。
[0013]在其中一个实施例中，所述氨解反应满足(a)～(b)中至少一个条件：
[0014](a)所述氨解反应的温度为45℃～100℃；
[0015](b)所述氨解反应的时间为60min～200min。
[0016]在其中一个实施例中，所述固相载体与第一氨解处理液的质量体积比为(7～15)mg：(50～350)μL。
[0017]在其中一个实施例中，所述向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱的步骤之前还包括如下步骤：
[0018]向连接有寡核苷酸的固相载体中加入乙腈进行清洗，然后除去所述乙腈；向经所述乙腈清洗后的连接有寡核苷酸的固相载体中加入第二氨解处理液进行预处理，然后除去所述第二氨解处理液；
[0019]所述第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～14)。
[0020]在其中一个实施例中，所述固相载体为固相微球，所述固相微球承载于合成柱中，所述合成柱的柱体积为400μL，所述乙腈的加入量为(50～350)μL，所述第二氨解处理液的加入量为(50～350)μL。
[0021]在其中一个实施例中，除去所述乙腈和/或所述第二氨解处理液的方法为真空抽滤，所述真空抽滤的步骤满足(c)～(d)中至少一个条件：
[0022](c)所述真空抽滤的真空度为
‑
5英寸汞柱；
[0023](d)所述真空抽滤的时间≥1min。
[0024]在其中一个实施例中，在所述氨解反应之后还包括冷冻处理，所述冷冻处理的步骤满足(e)～(f)中至少一个条件：
[0025](e)所述冷冻处理的冷冻温度为
‑
15～
‑
25℃；
[0026](f)所述冷冻处理的冷冻时间为15min～20min。
[0027]与传统方法相比较，本申请的寡核苷酸氨解方法具有如下有益效果：
[0028]上述寡核苷酸氨解方法中，采用先切割洗脱再氨解的方式，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，将碱基上的氨基保护基团去除，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。其中，氨解处理液是热的良导体，有利于将密封加热装置提供的加热温度快速传递到反应室内部，高效引发氨解处理液气化和氨解反应的发生；同时密封条件下有效避免了氨解处理液的挥发损失，有助于高效完成氨解反应。
附图说明
[0029]图1为实施例1中的寡核苷酸的MS图谱；
[0030]图2为实施例1中的寡核苷酸的分析图谱；
[0031]图3为实施例2中的寡核苷酸的MS图谱；
[0032]图4为实施例2中的寡核苷酸的分析图谱；
[0033]图5为实施例3中的寡核苷酸的MS图谱；
[0034]图6为实施例3中的寡核苷酸的分析图谱；
[0035]图7为实施例4中的寡核苷酸的MS图谱；
[0036]图8为实施例4中的寡核苷酸的分析图谱；
[0037]图9为实施例5中的寡核苷酸的MS图谱；
[0038]图10为实施例5中的寡核苷酸的分析图谱；
[0039]图11为实施例6中的寡核苷酸的MS图谱；
[0040]图12为实施例6中的寡核苷酸的分析图谱；
[0041]图13为实施例7中的寡核苷酸的MS图谱；
[0042]图14为实施例7中的寡核苷酸的分析图谱；
[0043]图15为对比例1中的寡核苷酸的MS图谱；
[0044]图16为对比例1中的寡核苷酸的分析图谱；
[0045]图17为对比例2中的寡核苷酸的MS图谱；
[0046]图18为对比例2中的寡核苷酸的分析图谱；
[0047]图19为对比例3中的寡核苷酸的MS图谱；
[0048]图20为对比例3中的寡核苷酸的分析图谱；
[0049]图21为对比例4中的寡核苷酸的MS图谱；
[0050]图22为对比例4中的寡核苷酸的分析图谱；
[0051]图23为对比例5中的寡核苷酸的MS图谱；
[0052]图24为对比例5中的寡核苷酸的分析图谱；
[0053]图25为对比例6中的寡核苷酸的MS图谱；
[0054]图26为对比例6中的寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸氨解方法，其特征在于，包括以下步骤：向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液，所述洗脱处理的时间为30min～120min，所述洗脱处理的温度为18℃～28℃；将所述第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；其中，所述第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。2.如权利要求1所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1)：(1～4)。3.如权利要求1所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：1：2。4.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述洗脱处理的时间为45min～90min。5.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述氨解反应满足(a)～(b)中至少一个条件：(a)所述氨解反应的温度为45℃～100℃；(b)所述氨解反应的时间为60min～200min。6.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述固相载体与第一氨解处理液的质量体积比为(7～15)mg：(50～350)μL。7.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述向连接有寡核苷酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜军，陆存银，余大伍，
申请(专利权)人：苏州梓熙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：