一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了一种实现着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法，试剂盒包括用于扩增(CAG)n序列的引物对，引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物；系统包括：样本预处理装置，用于从外滋养层细胞获得核酸样本；特定核酸序列扩增装置，使用试剂盒对ATXN3基因中包含(CAG)n序列的部分进行扩增；以及判断装置，以便对所述扩增得到的产物进行分析对比，得到n的数值；方法包括：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用mRNA反转录引物进行反转录，然后使用反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；使用本发明专利技术的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；对扩增得到的产物进行毛细管电泳，然后进行分析，得到n。得到n。得到n。

【技术实现步骤摘要】
一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法


[0001]本专利技术涉及生物医疗领域，本申请属于分子生物学
，具体涉及一种基于转录组mRNA对着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒、系统和方法。

技术介绍

[0002]脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias，SCA)是一组存在高度临床异质性和遗传异质性的神经系统退行性疾病，呈常染色体显性遗传。临床上主要表现为慢性进行性加重的小脑共济失调，并可能伴有不同程度眼外肌麻痹、吞咽困难、构音障碍、锥体系和锥体外系症状、周围神经病变和自主神经功能障碍等。SCA的全球发病率约为0.03
‰
，已发现超过40种亚型，其中共济失调蛋白3(SCA3)，又被称为Machado
‑
Joseph Disease(MJD)，的全球发病率最高，并且也是我国最常见的亚型，占我国所有SCA患者的48
‑
73％。本病目前发病机制尚不清楚，并且临床主要进行对症治疗，尚无有效的治疗药物。因此，对SCA3患者进行遗传学诊断，并在此基础上进行胚胎着床前遗传学诊断，是从出生缺陷一级预防层面降低SCA3发病率，减少患儿的出生，减轻家庭和社会负担的根本措施。
[0003]共济失调蛋白3的编码基因ATXN3的10号外显子区域的(CAG)n三核苷酸重复序列异常扩展是导致SCA3的主要原因。ATXN3基因位于14号染色体q32.1区域，包含12个外显子，其中10号外显子存在(CAG)n的动态变化区域。由ATXN3基因编码的共济失调蛋白3是一种重要的去泛素化酶,普遍表达于人体的神经元和非神经元各组织，参与基因转录、蛋白代谢、磷酸化以及自身泛素化水平的调节。对于中国人群的大样本测序研究发现，中国人群正常CAG重复范围是13次至49次，而异常的重复次数范围为52至91次。
[0004]目前SCA3成人ATXN3基因检测的样本来源于外周血，提取后可获得几微克基因组DNA，后续采用连接有荧光基团的引物通过PCR结合毛细管电泳的方法进行检测。着床前胚胎中ATXN3基因检测样本是来自于囊胚期胚胎外滋养层活检的细胞。相较于成人通过外周血基因组DNA检测，胚胎活检获得的细胞数量少，获得基因组DNA量在皮克级别，在全基因组扩增过程中存在脱扣的可能，并且ATXN3基因的(CAG)n重复动态变化区为高GC区域，增大了检测的困难性。因此，目前对于胚胎中ATXN3基因的检测主要方法是对全基因组文库构建后进行二代测序，通过男女双方单核苷酸多态性进行家系连锁分析，间接判断胚胎是否携带ATXN3基因变异，对于无遗传家族史的SCA3患者，无法通过家系的连锁分析对胚胎进行间接检测。
[0005]目前现有方法尚不能通过对胚胎的ATXN3基因(CAG)n动态重复位点进行直接检测，需要能够对胚胎的ATXN3基因进行检测的方法和试剂盒。
[0006]另外，人工授精产生的受精卵的基因检测，一直受到样本量过低的限制，很难开展，要么过于昂贵，例如单细胞测序，要么现有方法无法进行，所以也需要一种廉价、易操作的方法，可以对着床前胚胎进行基因检测的方法和系统。

技术实现思路

[0007]为了解决前述的问题，第一方面，本专利技术提供一种实现着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒，其包括用于扩增的引物对，所述引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物，
[0008]所述上游引物的序列设计成：
[0009]位于ATXN3基因的外显子1至9中(CAG)n序列上游的任意位置；
[0010]所述下游引物的序列设计成：
[0011]位于ATXN3基因的外显子11至12中(CAG)n序列上游的任意位置。
[0012]可选地，所述上游引物的序列位于ATXN3基因的外显子9或者跨外显子8和9，所述下游引物的序列位于ATXN3基因的外显子11。
[0013]优选地，引物的核苷酸个数为15
‑
25，GC含量在40
‑
60％。
[0014]可选地，本专利技术的试剂盒中，所述引物对为选自以下任一引物对：
[0015]第一引物对：
[0016]第一上游引物：与SEQ ID No：1具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：1的核苷酸序为GCAAGGTAGTTCCAGAAACA，
[0017]第一下游引物：所述下游引物的序列与SEQ ID No：2具有至少90％或95％序列同一性，SEQ ID No：2的核苷酸序列为TCTAAAGACATGGTCACAGC；
[0018]第二引物对：
[0019]第二上游引物：与SEQ ID No：3具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：3的核苷酸序为TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA，
[0020]第二下游引物：与SEQ ID No：4具有至少90％或95％序列同一性，SEQ IDNo：4的核苷酸序列为AGCTGCCTGAAGCATGTC。
[0021]优选地，
[0022]第一引物对：
[0023]第一上游引物：GCAAGGTAGTTCCAGAAACA(SEQ ID No：1)，第一下游引物：TCTAAAGACATGGTCACAGC(SEQ ID No：2)；
[0024]第二引物对：
[0025]第二上游引物：TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA(SEQ ID No：3)，第二下游引物：AGCTGCCTGAAGCATGTC(SEQ ID No：4)。
[0026]可选地，本专利技术的试剂盒中，所述荧光基团为FAM，FAM是一种具有共轭双键体系结构的化合物，在受到492nm波长的光激发后，可发出518nm的发射波长。
[0027]本专利技术的试剂盒，还可以包括反转录引物。
[0028]可选的，所述反转录引物为polyT，对含有PolyA尾的完整mRNA末端起始反转录反应，使mRNA反转成cDNA；
[0029]第二方面，本专利技术提供一种检测着床前胚胎ATXN3基因中(CAG)n序列重复次数n的方法，其包括以下步骤：
[0030]裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；
[0031]使用本专利技术的权利要求1至3中任一项所述的试剂盒与所述核酸样本进行目标序
列的扩增；
[0032]对所述扩增得到的产物进行毛细管电泳，然后进行分析，得到n。
[0033]可选地，所述反转录引物是polyT或针对所述ATXN3的反转录引物。
[0034]第三方面，本专利技术提供用于着床前胚胎ATXN3基因检测的系统，其包括：
[0035]样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
[0036]特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用本专利技术的试剂盒对ATX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增(CAG)n序列的引物对，所述引物对包括下游引物和荧光基团修饰的上游引物，所述上游引物的序列设计成：位于ATXN3基因的外显子1至9中(CAG)n序列下游的任意位置；所述下游引物的序列设计成：位于ATXN3基因的外显子11至12中(CAG)n序列上游的任意位置；所述上游引物和下游引物中任一的核苷酸个数为15
‑
25，GC含量在40
‑
60％。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自以下任一引物对：第一引物对：第一上游引物：GCAAGGTAGTTCCAGAAACA(SEQ ID No：1)，第一下游引物：TCTAAAGACATGGTCACAGC(SEQ ID No：2)；第二引物对：第二上游引物：TCAGAAGAGCTTCGGAAGAGA(SEQ ID No：3)，第二下游引物：AGCTGCCTGAAGCATGTC(SEQ ID No：4)。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM。4.一种检测着床前胚胎ATXN3基因中(CAG)n序列重复次数n的方法，其特征在于，包括以下步骤：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；使用本发明的权利要求1至3中任一项所述的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；对所述扩增得到的产物进行毛细管电泳，然后进行分析，得到n。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反转录引物为polyT或针对所述ATXN3的反转录引物。6.一种用于着床前胚胎ATXN3基因检测的系统，其特征在于，包括：样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用权利要求1至3中任一项所述的试剂盒对ATXN3基因中包含(CAG)n序列的部分进...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，王玉倩，闫丽盈，朱小辉，严智强，迟洪滨，智旭，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：