一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法技术方案

本发明专利技术提供了用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒及其应用，该试剂盒包括设计的n个引物对中的一个或更多个引物对，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，依此类推，第n对引物的上游引物位于第n

【技术实现步骤摘要】
一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法


[0001]本专利技术涉及生物医疗领域，具体涉及一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法。

技术介绍

[0002]Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)传统上称为von Recklinghausen病，是一种累及神经系统的常染色体显性遗传疾病，导致常见的肿瘤易感性综合征。其全球发病率约为1/3 000，约50％的患者为家族性遗传突变，其余为散发型突变。Ⅰ型神经纤维瘤病是由染色体17q11.2上的NF1基因变异导致引起的。NF1基因编码一种称为神经纤维蛋白的GTP酶激活蛋白，NF1基因变异导致神经纤维蛋白的失活进而易于肿瘤形成。NF1在基因组中跨越超过275kb，包含57个组成型外显子和至少三个交替剪接的外显子。此外，人类基因组中还存在15个与NF1基因高度同源的假基因。因此，NF1基因的检测在成人中存在一定困难。
[0003]NF1是一种儿童期后，呈完全显性的遗传病，没有无症状携带者。典型的临床症状包括咖啡牛奶斑(cafe
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au
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lait macules,CALMs)、多发性神经纤维瘤、腋窝或腹股沟雀斑等。患者病变以神经纤维瘤为特征性表型，其中皮肤型神经纤维瘤数量大，丛状神经纤维瘤累及主干神经，恶变后的恶性外周神经鞘瘤生存期极短。同时NF1患者伴有多系统累及，疾病致畸率、致残率高，手术难以完整切除，目前尚无有效治疗手段。
[0004]对于该疾病家庭来说，单基因病胚胎着床前遗传学检测(preimplantation genetic testing for monogenic defects,PGT
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M)是一种有效的方式，能够阻断NF1基因变异向后代传递。目前PGT
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M主要是在囊胚期经过活检获得微量的遗传分析材料，由于所得材料的DNA在皮克级别，相较于成人通过外周血基因组DNA检测，胚胎活检获得的细胞数量少，在全基因组扩增过程中存在脱扣的可能，一般需经过全基因组扩增(whole
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genome amplification,WGA)后再进行后续诊断分析。要么过于昂贵，例如单细胞测序，要么现有方法无法进行，所以也需要一种廉价、易操作的方法，可以对着床前胚胎进行基因检测的方法和系统。
[0005]针对NF1的PGT
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M检测方法主要包括：1.直接位点的检测；2.依靠家系进行连锁分析进而明确胚胎是否携带变异。在直接位点检测方面，用于胚胎遗传学检测的细胞数目仅有5个左右，经全基因扩增后，直接位点检测存在等位基因脱扣(allele drop
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out,ADO)的风险。并且NF1存在15个高度同源的假基因，会对胚胎的诊断造成干扰加大了检测的难度的同时也存在误诊的风险。在连锁分析诊断方面，基于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)或短串联重复序列(short tandem repeat,STR)的家系连锁分析可以准确对胚胎进行诊断。但对于约50％的新发变异患者来说，无法依靠家系成员进行连锁分析。目前常规诊断的方法，在Ⅰ型神经纤维瘤病的胚胎遗传学检测方面，存在一定的局限性以及检测失败甚至误诊的风险。

技术实现思路

[0006]为了解决前述的问题，本专利技术提供一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒及其应用。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括设计的n个引物对中的一个或更多个引物对，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，依此类推，第n对引物的上游引物位于第n
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1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了NF1基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在NF1基因无假基因的不同外显子区域。
[0008]在一些实施例中，用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对中的一对或更多对，4个引物对具体如下：
[0009]1).引物对1
[0010]覆盖外显子1
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7，扩增片段长度900bp
[0011]上游引物：ACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：1)
[0012]下游引物：TGCTTTACGTTTGGTGCTTTC(SEQ ID No：2)
[0013]2).引物对2
[0014]覆盖外显子8
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29，扩增片段长度3382bp
[0015]上游引物：GGTTGCGCAGTTAGCAGTTAT(SEQ ID No：3)
[0016]下游引物：CTCAAGGCTCTCTGATGGTTCTA(SEQ ID No：4)
[0017]3).引物对3
[0018]覆盖外显子30
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40，扩增片段长度2329bp
[0019]上游引物：GCTTTGAAGTGGATCCTACCA(SEQ ID No：5)
[0020]下游引物：GGACCTGTGGCTACTAAGAAAG(SEQ ID No：6)
[0021]4).引物对4
[0022]覆盖外显子41
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57，扩增片段长度2674bp
[0023]上游引物：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：7)
[0024]下游引物：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：8)。
[0025]优选地，该试剂盒具有4个引物对，4个引物对可以独立包装，即一次可以使用一个引物对，也可以使用多个引物对，进一步优选地，使用全部4个引物对。
[0026]在另一些实施例中，用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其包括以下3个引物对中的一对或更多对，3个引物对具体如下：
[0027]1).引物对5覆盖外显子1
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21，扩增片段长度3121bp
[0028]上游引物5：CAGACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：9)
[0029]下游引物5：TCCCAAGCACACGAACATAC(SEQ ID No：10)
[0030]2).引物对6覆盖外显子22
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40，扩增片段长度3362bp
[0031]上游引物6：GGATCGGCTGTTGTCCTTAAT(SEQ ID No：11)
[0032]下游引物6：CTACAGCAGTATCTGCCATCAC(SEQ ID No：12)
[0033]3).引物对7覆盖外显子41
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57，扩增片段长度2674
[0034]上游引物7：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括设计的n个引物对中的一个或更多个引物对，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，依此类推，第n对引物的上游引物位于第n
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1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了NF1基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在NF1基因无假基因的不同外显子区域。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括以下4个引物对中的一个或更多个，所述4个引物对具体如下：1)引物对1上游引物1：ACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：1)下游引物1：TGCTTTACGTTTGGTGCTTTC(SEQ ID No：2)2)引物对2上游引物2：GGTTGCGCAGTTAGCAGTTAT(SEQ ID No：3)下游引物2：CTCAAGGCTCTCTGATGGTTCTA(SEQ ID No：4)3)引物对3上游引物3：GCTTTGAAGTGGATCCTACCA(SEQ ID No：5)下游引物3：GGACCTGTGGCTACTAAGAAAG(SEQ ID No：6)4)引物对4上游引物4：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：7)下游引物4：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：8)3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括以下3个引物对中的一个或更多个，所述3个引物对具体如下：1)引物对5上游引物5：CAGACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：9)下游引物5：TCCCAAGCACACGAACATAC(SEQ ID No：10)2)引物对6上游引物6：GGATCGGCTGTTGTCCTTAAT(SEQ ID No：11)下游引物6：CTACAGCAGTATCTGCCATCAC(SEQ ID No：12)3)引物对7上游引物7：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：13)下游引物7：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：14)。4.一种用于着床前胚胎NF1基因检测的系统，其特征在于，包括：样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用权利要求1或2所述的试剂盒对NF1基因的至少一部分进行扩增；测序装置，所述测序装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行测序分析。5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；反转录单元，所述反转录单元通过将反转录试剂加入所述细胞裂解单元得到，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。6.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述外滋养层细胞是囊胚期的外滋养层细胞。7.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述细胞裂解单元中裂解细胞是这样进行的：将所述外滋养层细胞置于裂解液中，充分震荡30
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60秒，然后72℃孵育，使细胞裂充分解，所述裂解液包含RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X
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100、无核酸酶水。8.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述样本预处理装置还包括纯化单元，得到所述核酸样本之前，在所述纯化单元中使用磁珠对所述核酸扩增单元得到的产物进行纯化。9.一种用于着床前胚胎NF1基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉倩，朱小辉，王楠，龙川，阔瀛，乔杰，闫丽盈，张春梅，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：