用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，属于生物技术领域。该用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括RPA引物和探针。本发明专利技术还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，所述RPA

【技术实现步骤摘要】
用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法。

技术介绍

[0002]鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)，属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)，是鱼类诺卡氏菌病的主要致病菌。鰤鱼诺卡氏菌可感染包括淡水养殖鱼种和海水养殖鱼种在内的40余种鱼类，如大口黑鲈(Micropterus salmoides)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、乌鳢(Channa argus)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)等。鱼体感染鰤鱼诺卡氏菌后的发病症状主要为肝脏、脾脏和肾脏组织形成大量白色结节。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到30％
‑
60％，患病鱼死亡率高，对水产养殖业造成了较大的经济损失。
[0003]由于鰤鱼诺卡氏菌感染早期为隐性感染，通常在中晚期才发现明显症状，所以需要对鰤鱼诺卡氏菌进行早期检测。此外，鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，因此从患病鱼体分离出鰤鱼诺卡氏菌的分离率较低，通过传统的细菌分离和生化鉴定准确率差。分子检测方法具有灵敏度高、时间短、操作简单等优点。目前已有报道基于分子技术检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR反应和环介导等温扩增技术。然而，PCR和实时荧光定量PCR反应操作过程复杂、耗时且依赖于昂贵的设备(如PCR仪等)，不适合现场快速检测；环介导等温扩增技术需要在60
‑
65℃完成，需要水浴锅或恒温箱，且在此温度下反应容易因气溶胶污染产生假阳性，因此也不适宜鰤鱼诺卡氏菌的渔场检测。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他DNA扩增方法相比具有多项优势，特别是其可在非实验室环境下应用。重组酶聚合酶反应特异性强，可在25
‑
45℃的恒温条件下反应15
‑
30min即可实现特定寡核苷酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求极低，通过优化后，可以完全不需要大型或昂贵的硬件设备，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，具有灵活性好和实用性强等优点，特别适用于渔场的病原检测，如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测是现有技术的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述技术不足，提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，解决现有技术中如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测。
[0006]为达到上述技术目的，本专利技术的技术方案提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括RPA引物和探针；
[0007]所述RPA引物上游引物和下游引物的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和
SEQ ID NO.2所示，且下游引物5
’
端标记生物素；
[0008]所述上游引物的序列为：
[0009]5’‑
GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC
‑3’
；
[0010]所述下游引物的序列为：
[0011]5’‑
CGCTCTTACAAACTTACTAACAAAGATGCTCGC
‑3’
；
[0012]所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；且5
’
端标记羧基荧光素FAM，3
’
端添加延伸阻断基团C3 Spacer，在第34
‑
35位碱基之间增加一个四氢呋喃，所述探针的序列为：
[0013]5’‑
CTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTACTCAGTG
‑3’
。
[0014]此外，本专利技术还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，所述RPA
‑
LFD试剂盒包括上述RPA组合物。
[0015]进一步地，所述RPA
‑
LFD试剂盒还包括阳性对照。
[0016]进一步地，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
[0017]进一步地，所述RPA
‑
LFD试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
[0018]进一步地，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行RPA
‑
LFD检测。
[0019]此外，本专利技术还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
[0020]S1、提取待测样品DNA；
[0021]S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物进行RPA扩增反应得到产物；
[0022]S3、分析步骤S2得到的产物。
[0023]进一步地，在步骤S3中，将所述产物通过琼脂糖凝胶电泳检测进行分析。
[0024]进一步地，在步骤S2中，所述扩增反应的温度为25
‑
45℃，时间为10min以上。
[0025]进一步地，在步骤S3中，使用侧向层析试纸条对产物进行分析：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：本专利技术提出的用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物能够实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测，能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
附图说明
[0027]图1为引物和探针筛选的结果，每组引物组合均设置了阴性对照。(A)分别使用9组引物组合对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行基础RPA扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，M：DL2000，1和2：F1/R1；3和4：F1/R2；5和6：F1/R3；7和8：F2/R1；9和10：F2/R2；11和12：F2/R3；13和14：F3/R1；15和16：F3/R2；17和18：F3/R3；19：阳性对照；(B)将2条探针分别与F2、R2组合，对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行RPA
‑
LFD扩增，试纸条的检测线和质控线的显色情况，1和2：F2/R2/probe1；3和4：F2/R2/probe2。
[0028]图2为不同反应条件对RPA
‑
LFD扩增效果的影响。(A)不同反应温度对RPA
‑
LFD扩增效果的影响，图中1
‑
8号试纸条的反应温度分别为20℃，25℃，30℃，35℃，38℃，40℃，45℃和50℃；(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，其特征在于，包括RPA引物和探针；所述RPA引物上游引物和下游引物的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且下游引物5
’
端标记生物素；所述上游引物的序列为：5
’‑
GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC
‑3’
；所述下游引物的序列为：5
’‑
CGCTCTTACAAACTTACTAACAAAGATGCTCGC
‑3’
；所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；且5
’
端标记羧基荧光素FAM，3
’
端添加延伸阻断基团C3 Spacer，在第34
‑
35位碱基之间增加一个四氢呋喃，所述探针的序列为：5
’‑
CTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGAT CGGTACTCAGTG
‑3’
。2.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于，所述RPA
‑
LFD试剂盒包括如权利要求1所述的RPA组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA
‑
LFD试剂盒还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：张旭杰，张永安，刘训，谭淑芳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：