一种添加中药材的改良减血清细胞培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，制备方法为将无血清基础培养基充分溶解于超纯水中，使基础培养基的终浓度为13.7g/L，然后加入5

【技术实现步骤摘要】
一种添加中药材的改良减血清细胞培养基


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其是涉及一种添加中药材的改良减血清细胞培养基。

技术介绍

[0002]山楂又称红果、山里红，属于蔷薇科山楂属，我国是山楂属植物的起源中心之一，山楂属植物在我国分布有18个种1个变种，其中大果山楂是我国特有的变种之一，也是我国北方山楂产区的主要栽培种。目前，我国北方山楂栽培面积为8.67万公顷，年产量150多万吨。
[0003]山楂果实具有很高的营养价值，是药食同源的上等补品，其中氨基酸种类丰富，包括8种必需氨基酸；蛋白质含量是同重量苹果含量的17倍；含有的维生素主要是维生素A、C、D、B1、B2、B3，含有多种矿物质，其中钙含量在水果中位列第一；还含有绿原酸、表儿茶酚、胆碱等30多种活性物质。
[0004]现代研究表明，山楂核富含木脂素、黄酮和三萜类成分，具有抗菌、抗炎、降血脂等多种药理活性。利用UHPLC
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结合UNIFI数据分析平台和多元统计方法，从山楂叶中共分析鉴定出58个化学成分，包括有机酸类成分6个、黄酮类成分16个、三萜酸类成分24个、单萜及倍半萜类成分12个。
[0005]目前，培养293T17细胞、ST细胞、vero细胞、BHK21细胞、SF9细胞的培养基均含有动物血清，而动物血清中的成分可能与其他成分形成具有细胞毒性作用的物质而影响细胞生长繁殖，还可能会成为血液媒介病原菌的感染源、异种抗原。
[0006]此外，添加的动物血清为胎牛血清或新生牛血清，来源困难，价格昂贵，还存在批间差异，细胞培养效果不稳定。而降低血清含量的培养基极易出现细胞增殖速度差，细胞形态结构改变的问题。因此，十分有必要研制出一款血清含量低、安全性高、培养效果好的培养基。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，以解决目前293T17细胞、ST细胞、vero细胞、BHK21细胞、SF9细胞的常规培养基中动物血清含量高，可能产生细菌毒素、携带病原体以及生产成本高，而减血清培养基培养效果不理想的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，制备方法为将无血清基础培养基充分溶解于超纯水中，使基础培养基的终浓度为13.7g/L，然后加入5～20μg/mL山楂及山楂叶提取物，搅拌使各成分混合均匀，再加入4％动物血清并搅拌，使各组分充分混合，最后将溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌即可。
[0009]优选的，所述山楂及山楂叶提取物的提取方法为：
[0010]S1、除去山楂及山楂叶中的病果、病叶及表面浮尘、病菌和虫卵；
[0011]S2、将山楂与山楂叶用研磨机充分研磨，使粉末颗粒均匀细致，然后过80目筛；
[0012]S3、将所述步骤S2获得的混合物粉末加水煮沸，过滤残渣，将滤液除菌后密闭置于4℃。
[0013]优选的，所述步骤S1中保留山楂的果核及果柄；所述步骤S2中山楂与山楂叶以质量比1:1的比例混合；山楂与山楂叶用研磨机研磨25～30min，然后过筛，将筛上剩余的大颗粒混合物再次置于研磨机中研磨，然后再过筛，再研磨，直至所述山楂及山楂叶全部过筛。
[0014]优选的，所述步骤S3中步骤S2获得的混合物粉末中加入的水为超纯水，所述混合物粉末与超纯水的质量体积比为1g:10mL。
[0015]优选的，所述步骤S3中将混合物粉末与超纯水加入带盖子的洁净烧杯中，放入水浴锅中煮沸，煮沸后滤掉残渣，再将滤液置于水浴锅中煮沸，如此反复直至不见滤渣，煮沸时间共计0.5～1h，煮沸过程中将烧杯的盖子稍拧紧，使烧杯中的超纯水蒸发率控制在8～12％。
[0016]优选的，所述步骤S3中将山楂及山楂叶提取物置于4℃不少于4h，然后吸取上部提取物用于配制培养基，留除底部沉淀。
[0017]一种如上所述的添加中药材的改良减血清细胞培养基在培养293T17、ST、vero、BHK21、SF9细胞中的应用。
[0018]因此，本专利技术提供的一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，其具体技术效果如下：
[0019](1)本专利技术的减血清细胞培养基通过添加山楂及山楂叶提取物，大大降低了动物血清的用量，却可以很好的保证培养细胞的形态，在促进细胞增殖方面甚至稍好于高浓度胎牛血清培养基的效果，且培养效果稳定；
[0020](2)本专利技术的减血清细胞培养基以价格低廉的原材料替代动物血清，大大降低了生产成本，同时还可以避免添加高浓度血清造成的培养基存在批次间不稳定、细胞毒性等问题；
[0021](3)本专利技术的减血清细胞培养基充分利用了山楂、山楂叶及山楂种子对促进我国农村经济发展、增加农民收入有重要作用；对减少农业废弃物、保护环境和经济的可持续发展具有重要意义。
[0022]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0023]图1为本专利技术对比例一、对比例二、实施例五至实施例八中细胞汇合度图；
[0024]图2为本专利技术对比例一、对比例二、实施例五至实施例八中细胞增殖倍数图；
[0025]图3为本专利技术对比例一与实施例六中不同代数细胞的汇合度趋势图；
[0026]图4为本专利技术对比例一与实施例六中不同代数细胞的增殖倍数趋势图；
[0027]图5为本专利技术对比例一、对比例二、实施例五至实施例八中细胞复层情况趋势图；
[0028]图6为本专利技术对比例一、对比例二、实施例五至实施例八中细胞透光情况趋势图；
[0029]图7为本专利技术对比例一、对比例二、实施例五至实施例八的培养基培养的293T17细胞图。
具体实施方式
[0030]以下通过附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0031]实施例一
[0032]制备一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，步骤为：
[0033](1)准确称取山楂50g，山楂叶50g，除去山楂及山楂叶中的病果、病叶及表面浮尘、病菌和虫卵。然后将山楂与山楂叶加入研磨机中研磨25min，然后过筛，将筛上剩余的大颗粒混合物再次置于研磨机中研磨，然后再过筛，再研磨，直至所述山楂及山楂叶全部过筛。
[0034](2)将步骤(1)中获得的山楂与山楂叶的混合物粉末加入洁净的烧杯中，然后向烧杯中加入1L超纯水，根据以往实验结果将烧杯盖子稍拧紧，置于水浴锅中煮沸，煮沸5min，然后滤掉滤渣，再将滤液煮沸，煮沸15min，然后滤掉滤渣，再次将滤液煮沸，煮沸15min后过滤，最后将煮沸好的滤液置于4℃备用。
[0035](3)步骤(2)获得的山楂及山楂叶提取物置于4℃4h后，准确称取DMEM基础培养基(Gibco公司生产)干粉13.7g，超纯水1L，向基础培养基中加入少量超纯水并搅拌，使培养基充分溶解，然后从步骤(2)获得的山楂及山楂叶提取物上部吸取50μL加入溶液中，即以山楂及山楂叶混合物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，其特征在于：制备方法为将无血清基础培养基充分溶解于超纯水中，使基础培养基的终浓度为13.7g/L，然后加入5
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20μg/mL山楂及山楂叶提取物，搅拌使各成分混合均匀，再加入4％动物血清并搅拌，使各组分充分混合，最后将溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌即可。2.根据权利要求1所述的一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，其特征在于，所述山楂及山楂叶提取物的提取方法为：S1、除去山楂及山楂叶中的病果、病叶及表面浮尘、病菌和虫卵；S2、将山楂与山楂叶用研磨机充分研磨，使粉末颗粒均匀细致，然后过80目筛；S3、将所述步骤S2获得的混合物粉末加水煮沸，过滤残渣，将滤液除菌后密闭置于4℃。3.根据权利要求2所述的一种添加中药材的改良减血清细胞培养基，其特征在于：所述山楂及山楂叶为购买的干山楂及山楂叶；所述步骤S1中保留山楂的果核及果柄；所述步骤S2中山楂与山楂叶以质量比1:1的比例混合；山楂与山楂叶用研磨机研磨25～30min，然后过筛，将筛上剩余的大颗粒混...

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒博，赵峻岭，黄新朋，
申请(专利权)人：内蒙古奥普赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：