实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组制造技术

本发明专利技术公开了实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组，本发明专利技术选用尖孢镰刀菌跨膜蛋白的基因为特异性检测位点，设计了6条特异性且在65℃下恒温扩增的实时荧光LAMP检测引物，用于尖孢镰刀菌的快速分子检测，在该LAMP检测体系下，使用10

【技术实现步骤摘要】
实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组


[0001]本专利技术属于植物病原菌检测
，具体涉及一种利用实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组和试剂盒。

技术介绍

[0002]三七[Panax notoginseng (Burk.).F.H. Chen] 是我国珍贵的中草药，能促进血液循环，防止血瘀，消肿消炎，缓解疼痛，延缓衰老，又被誉为“血管清道夫”。三七中具有药理活性的主要成分为三七总皂苷。由于三七独特的功效，用途不断拓展，市场需求较多。三七主要种植于云南文山州，喜阴湿，种植周期长，病害多发。研究表明三七的主要病害包括根腐病、病毒病、灰霉病等。近年来，病害种类、发病面积及严重程度呈上升趋势，在这些病害中，主要由致病真菌引起的根腐病是最具破坏性的病害之一，可导致药用部位腐烂，甚至全株死亡。
[0003]三七根腐病是典型的土传性病害，俗称烂头子，主要包括黄腐型、髓烂型及湿腐型等。根腐病能导致三七根部的腐烂或者干枯，直接导致三七药材的产量及品质下降。传播途径主要是病土、带菌流水污染种子及种苗带菌和传播，其中近距离传播以带菌土壤和带菌流水为主，远距离传播以种苗带菌扩散为主。根腐病的病原体种类多样，包括一些真菌、细菌、线虫等，其中镰刀属真菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）也是重要的根腐病菌之一。
[0004]准确识别和检测病原体是有效预防和控制病害的基础。传统鉴定和检测病原菌的步骤包括从感病组织中分离病原体，然后根据形态学特征进行初步鉴定，这种基于形态学的识别不仅困难，而且费时费力，不能满足快速准确识别和诊断病害的需求。聚合酶链式反应PCR技术提高了病原体鉴定的准确性和检测的快速性，但是它们很复杂并且需要昂贵的设备，例如精确的PCR仪器和凝胶成像系统，以及其他分子生物学设备。上述缺点限制了PCR技术在现场检测中的使用和推广。因此，有必要建立一种快速、经济的现场植物病原菌检测新技术。
[0005]环介导等温扩增(LAMP)是一种简单、准确、低成本和高效的核酸扩增技术。在LAMP检测中，根据靶基因的6
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8个特定区域设计4
‑
6条引物，如果任何一条引物与靶基因不匹配，扩增就无法进行，因此LAMP具有很强的特异性。此外，LAMP使用高活性的链置换DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在60
–
65℃的等温温度下有效扩增目标DNA片段，因此，只需简单的水浴或加热块即可满足反应要求，整个反应在一小时内完成，并且可以用肉眼观察结果。这种技术具有高特异性、最低设备要求、操作简单、高灵敏度和反应时间短的优点，并已被广泛用于检测多种植物病原体。因此，开发一种快速准确的现场检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的LAMP检测方法势在必行。

技术实现思路

[0006]为了达到对三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的快速准确检测的要求，及时阻断传播并高效特异防治，避免造成大面积损失，本专利技术提供了检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的实
时荧光LAMP引物组及LAMP检测试剂盒，通过该方法能简单快速准确的检测出三七植株及土壤中尖孢镰刀菌的含量。
[0007]本专利技术实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组的的核苷酸序列如下：TP
‑
FIP:5
’‑
CGACCTATTAAGTGGCACGAGTACCTCACCACTTCCTGTT
‑3’
TP
‑
BIP:5
’‑
GCTTTGGAGTTCCCAGAACCAATCGACATATCTATCGAAGCAC
‑3’
；TP
‑
F3:5
’‑
CTCGTCTCAAGCACACTG
‑3’
TP
‑
B3:5
’‑
AAGAGCACTCCGTCATCT
‑3’
；TP
‑
LooF:5
’‑
GCTGGCAAGATTGAACGC
‑3’
TP
‑
LooR:5
’‑
CAGGACAATGATCAAAGTCGC
‑3’
；上述引物组以尖孢镰刀菌的跨膜蛋白（Transmembrane Protein）基因（NCBI登录号JK747097.1）为特异性检测位点。
[0008]本专利技术还提供了一种含有上述引物组的实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的试剂盒，其包括上述引物组以及LAMP检测所需的常规检测试剂；实时荧光LAMP检测体系包括：（1）25μL LAMP扩增体系为：10
×ꢀ
Isothermal Amplification Buffer II 2.5μL、MgSO
4 1μL (6 mM)、dNTP Mix 4μL (1.4mM)、TP
‑
F3 1μL (5μM)、TP
‑
B3 1μL (5μM)、TP
‑
FIP 1μL (40μM)、TP
‑
BIP 1μL (40μM)、TP
‑
LoopF 0.4μL (5μM)、TP
‑
LoopB 0.4μL (5μM)、Bst 3.0 DNA Polymerase 4U 0.5μL、20
×
Eva Green 1.25μL，DNA模板1μL，加入Nuclease
‑
free Water 补足到25μL；（2）10
×
TE缓冲液：含有100mM Tris
‑
HCl、10mM EDTA的水溶液，pH8.0，用于裂解样本以提取DNA。
[0009]实时荧光LAMP检测试剂盒还包含了质粒标准品，质粒是由跨膜蛋白基因插入T载体（pGEM
‑
T
‑
TP）构建而成。
[0010]利用上述试剂盒检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的方法如下：（1）采用10
×
TE缓冲液提取制备实时荧光LAMP的反应模板；（2）配制实时荧光LAMP的扩增体系；（3）在步骤（1）提取的模板中加入步骤（2）中配制的实时荧光LAMP扩增体系，混匀后在65℃恒温进行实时荧光LAMP反应，反应条件为：65℃ 30s，45个循环，反应结束后进行熔解曲线分析（95℃反应0.05s；65℃反应0.05s，按0.5℃/step的升温速率递增到95℃）；（4）实时荧光LAMP标准曲线的建立制备浓度在0.2pg/μL
ꢀ‑
20ng/μL的尖孢镰刀菌质粒标准品溶液，对不同浓度的溶液进行实时荧光LAMP反应，反应体系与扩增步骤同（2）和（3），每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；（5）结果诊断：若出现荧光信号则判定所检测样品中存在尖孢镰刀菌，并将得到的Ct本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的引物组，其特征在于，引物组的核苷酸序列如下：TP
‑
FIP:5
’‑
CGACCTATTAAGTGGCACGAGTACCTCACCACTTCCTGTT
‑3’
TP
‑
BIP:5
’‑
GCTTTGGAGTTCCCAGAACCAATCGACATATCTATCGAAGCAC
‑3’
；TP
‑
F3:5
’‑
CTCGTCTCAAGCACACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，李有玉，车晓莉，顾悦，甘昆发，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：