一种长链非编码RNASNHG9及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种长链非编码RNASNHG9及其应用，使用R语言DEGseq包对基因表达综合数据库胃癌数据集进行差异分析，获得目标基因；利用实时荧光定量PCR检测在胃癌组织及配对癌旁组织、胃癌细胞株与正常胃黏膜细胞株GES

【技术实现步骤摘要】
一种长链非编码RNA SNHG9及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种长链非编码RNA SNHG9及其应用。

技术介绍

[0002]目前，胃癌(Gastric cancer，GC)是常见的消化系统恶性肿瘤，发病隐匿，早期症状不典型，大多数患者确诊时已进入中晚期。胃癌晚期患者5年生存率仅为10～15％。因此目前迫切需要解决胃癌的早期诊断和发生发展机制问题。
[0003]lncRNAs是目前恶性肿瘤基因水平研究的热门。人们对lncRNAs深入研究后发现，很多的lncRNAs参与了肿瘤的发生发展，包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮
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间质细胞转化、凋亡、抗肿瘤耐药性等。在不同的恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌等中均已经发现多种差异性表达的lncRNAs，有一部分lncRNAs的表达水平已经被证实与肿瘤的恶性程度、侵袭范围、淋巴结转移有着密切关系，同时也发现一些lncRNAs能够作为恶性肿瘤诊疗及评估预后的潜在靶点。比如40％遗传性弥漫型胃癌患者中可以发现抑癌基因CDH1的突变；在弥散型胃癌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长链非编码RNA SNHG9，其特征在于，所述长链非编码RNA SNHG9的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。2.一种所述长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中的应用。3.一种鉴定所述长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法包括：使用R语言DEGseq包对基因表达综合数据库胃癌数据集GES63288进行差异分析，获得目标基因；利用实时荧光定量PCR检测在胃癌组织及配对癌旁组织、胃癌细胞株SNU
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1、HGC
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27、KATO3、NCI
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N87与正常胃黏膜细胞株GES
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1中目标基因的表达水平，与数据库分析结果进行相互验证；合成特异敲低目标基因表达的小干扰RNA，通过实验确定目标基因表达高低与胃癌发生发展的关系。4.如权利要求3所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，差异基因的筛选标准为：P小于0.05且表达差异倍数为2倍，|log2FC|>2且P<0.05。5.如权利要求3所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法包括以下步骤：步骤一，进行GEO数据下载及分析，确定目的基因；步骤二，分别进行细胞培养以及细胞转染；步骤三，进行实时荧光定量PCR扩增；步骤四，通过实验确定目标基因与胃癌的关系；步骤五，对实验数据进行统计学分析。6.如权利要求5所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，步骤一中的GEO数据下载及分析包括：在GEO网站逐项寻找并下载符合LncRNAs测序结果原始数据文件，使用R语言DEGseq包对GEO数据库胃癌数据集GES63288进行差异分析，差异基因的筛选标准为：P小于0.05且表达差异倍数为2倍，|log2FC|>2且P<0.05)，获得目标基因。7.如权利要求5所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，步骤二中的细胞培养包括细胞复苏、细胞传代以及细胞冻存；细胞复苏包括以下步骤：1)实验开始前30min打开水浴锅，预热温度37℃；2)将冻存于液氮中长期保存的胃癌细胞SNU
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1、HGC
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27、KATO3、NCI
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N87和正常胃黏膜细胞GES
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1取出，迅速放入提前预热的水浴锅中解冻；3)取出冻存管离心，1500rpm离心5min；4)于超净工作台内打开冻存管，弃去旧冻存液，保留下层沉积细胞，然后向其中加入2mL完全细胞培养基，吹打细胞至悬浮均匀；5)取小规格灭菌细胞培养瓶，加入5mL提前配置的完全培养基，将上述细胞悬液加入培养瓶；
6)高倍镜下观察细胞密度均匀；7)培养瓶右下角标记，后放入细胞培养箱中，条件按温度37℃，二氧化碳5％设定，定期观察状态；细胞传代包括以下步骤：1)提前30min紫外照射超净工作台；2)取出需传代的细胞，显微镜观察细胞密度，密度在80％～90％则可继续进行传代；3)弃去培养瓶内旧培养基，加入2mL灭菌PBS，轻轻晃动培养瓶润洗贴壁面，弃去PBS，此过程重复3遍；4)加入1mL胰酶，快速将细胞培养瓶置于高倍镜下，密切关注形态变化，待其开始变圆，加入1mL含有完全培养基终止消化，由下至上Z字形轻轻吹打贴壁面；5)将所得细胞悬液移至离心管中，1500rpm离心5min；6)弃去上层清液，向离心管中重新加入12mL完全培养基，重悬细胞；7)准备2个新的细胞培养瓶，将上述细胞悬液平均加入，各6mL；8)培养瓶右下角标记信息并放入培养箱中，设置如上，定期观察细胞生长状态；细胞冻存包括以下步骤：1)提前30min紫外照射超净工作台；2)确定需要冻存的细胞，显微镜确认细胞密度状态良好；3)弃去培养瓶内旧培养基，加入2mL灭菌PBS，轻轻晃动培养瓶润洗贴壁面，弃去PBS，此过程重复3遍；4)加入1mL胰酶，快速将细胞培养瓶置于高倍镜下，密切关注形态变化，待其开始变圆，加入1mL含有完全培养基终止消化，由下至上Z字形轻轻吹打贴壁面；5)移至离心管中，1500rpm离心5min；6)弃去上清，根据细胞密度加入合适冻存液，重悬细胞后将其转移至冻存管中，各1mL；7)标记细胞名称，代数，时间后放入
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80℃冰箱保存。若冻存时间较长，则将其放入液氮罐中保存；细胞转染包括以下步骤：1)提前30min紫外照射超净工作台；2)取出需传代的细胞，显微镜观察细胞密度及状态，细胞状态良好，细胞密度在80％～90％则可继续进行转染；3)弃去培养瓶内旧培养基，加入2mL灭菌PBS，轻轻晃动培养瓶润洗贴壁面，弃去PBS，此过程重复3遍；4)加入1mL胰酶消化，快速将细胞培养瓶置于高倍镜下，密切关注形态变化，待其开始变圆，立即加入1mL含有完全培养基终止消化，由下至上Z字形轻轻吹打贴壁面；5)移至离心管中，1500rpm离心5min；6)弃去上清，加入完全培养基，重悬细胞；7)显微镜下进行细胞计数，用完全培养基适当稀释细胞密度，以5
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104个/mL密度将细胞接种于六孔板，每孔2mL；8)标记细胞名称，分组后放入细胞培养箱中过夜；9)取1.5mL无酶EP管，分别加入无血清培养基250mL，根据分组标记为对照组和实验组；
10)取对照组和实验组EP管各一个，加入5μL lipofectamin 2000，轻轻混匀，静置5min；11)取另外的对照组和实验组EP管各一个，分别加入si
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NC或si
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SNHG95μL，100pmol；12)按组别标识，将步骤12所得混合物分别缓慢加入步骤11)所得混合液中，每孔各加入1.5mL不完全培养基，静置20min；13)取提前铺好的六孔板，弃去上清，将上述混合物分别加入对应孔中并标记清楚，晃动六孔板，使其分布均匀；14)转染后的六孔板放入细胞培养箱中；15)6h后取出转染的六孔板，弃去旧培养基，向每孔加入2mL完全培养基；16)继续置于细胞培养箱中48h，完成细胞的si
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SNHG9或si
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NC转染。8.如权利要求5所述鉴定长链非编码RNA SNHG9高表达作为胃癌治疗靶点在制备胃癌靶向药物中应用的方法，其特征在于，步骤三中的实时荧光定量PCR包括细胞总RNA提取、组织总RNA提取、总RNA浓度测定、反转录以及荧光定量PCR；细胞总RNA提取包括以下步骤：细胞总RNA提取采用OMGEA总RNA提取试剂盒进行；1)提前30min紫外照射超净工作台；2)取出需PCR检测的细胞，显微镜观察细胞密度及状态，确保状态良好，密度在80％～90％则可继续进行RNA提取；3)弃去培养瓶内旧培养基，加入2mL灭菌PBS，轻轻晃动培养瓶润洗贴壁面，弃去PBS，此过程重复3遍；5)加入1mL胰酶消化，快速将细胞培养瓶置于高倍镜下，密切关注形态变化，待其开始变圆，加入1mL含有完全培养基终止消化，吹打贴壁面；7)移至离心管中，1500rpm离心5min；8)弃去离心管上清，向离心管中加入250μLFTL液，震荡混匀；9)将上述离心管置于80℃水浴锅中水浴15min，后室温静置1min；10)加入20μL OB Protease液，震荡混匀；11)将离心管置于55℃水浴锅中水浴45min；12)按10000g离心3min；13)穿过离心管上层油脂，移液枪吸取200μL清液，移至1.5mL无酶离心管，弃去旧离心管；14)向离心管中加入220μL GTC及660μL无水乙醇，震荡混匀；15)取700μL上述样品转移至洗脱柱管中，高速离心机10000g离心1min，弃去废液，重复此步骤；16)向洗脱柱管中加入500μL RWB，高速离心机10000g离心1min，弃去废液，重复此步骤；17)更换新离心管，高速离心机10000g离心2min，弃去废液；19)将柱子放入1.5mL无酶离心管中，加50μL DEPC Treated water，室温放置3min；20)高速离心机10000g离心1min，弃去废液，备用；组织总RNA提取包括以下步骤：
组织总RNA提取采用OMGEA总RNA提取试剂盒进行；1)准备样本组织适量，将其放入1.5mL无酶离心管中，剪碎；2)向离心管中加入250μLFTL液，震荡混匀；3)将上述离心管置于80℃水浴锅中水浴15min，后室温静置1min；4)加入20μL OB Protease液，震荡混匀；5)将离心管置于55℃水浴锅中水浴45min；6)按10000g离心3min；7)穿过离心管上层油脂，移液枪吸取200μL清液，移至1.5mL无酶离心管；8)向离心管中加入220μL GTC及660μL无水乙醇，震荡混匀；9)取700μL上述样品转移至洗脱柱管中，高速离心机10000g离心1min，弃去废液，重复此步骤；10)向洗脱柱管中加入500μL RWB，高速离心机10000g离心1min，弃去废液，重复此步骤；11)更换新离心管，高速离心机10000g离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，徐翠香，黄晓燕，刘霄，常乐，
申请(专利权)人：陕西省人民医院，
类型：发明
国别省市：