一种抗氧化活性多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗氧化活性多肽及其制备方法，所述多肽为F1

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化活性多肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种抗氧化活性多肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]已有研究表明，正常情况下机体内自由基产生与清除处于动态平衡，当自由基产生增高或自由基清除减弱，过量的自由基对细胞的重要生物大分子化学结构产生破坏。随着损害的的加深，将会损伤组织形态和功能的完整性，当损伤程度超过修复或丧失其代偿能力时，组织器官功能就会逐步发生紊乱及障碍，表现出机体逐渐衰老。抗氧化能力与衰老和寿命的关系抗氧化物质与可期寿命有密切关系。
[0003]活性肽又称生物活性肽或生物活性多肽，主要控制人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢。活性肽广泛存在于自然界中，生物体很多活性物质都以肽的形式存在。目前研究者们已从多种不同生物体分离获得了不同的活性多肽，例如专利文献CN 112574282 B公开了从云南臭蛙的皮肤分泌物中提取到一种具有抵抗皮肤光损伤和氧化应激活性的天然多肽RL
‑
PP10，专利文献CN 104593457A公开了一种从蚯蚓中制备得到的具有自由基清除功效的小分子肽。但是，这些多肽的抗氧化功效不够突出。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种具有显著的抗氧化及延缓衰老作用的活性多肽。
[0005]本专利技术为了实现其目的，采用的技术方案是：
[0006]一种抗氧化活性多肽，所述多肽为F1
‑
2或者F1
‑
3，F1
‑/>2的氨基酸序列为EGKDEFRL，F1
‑
3的氨基酸序列为EIRIKHADRK。
[0007]本专利技术的另一目的是提供上述的抗氧化活性多肽的制备方法，采用人工合成方法制备。
[0008]优选地，所述人工合成方法为Fmoc多肽固相合成法。
[0009]优选地，上述的制备方法，按照所述活性多肽C端到N端的氨基酸顺序进行逐一的固相合成，具体合成方法如下：按照氨基酸顺序，将保护氨基酸原料和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和保护氨基酸侧链保护基，获得粗品，粗品纯化后获得所述蚯蚓合成多肽；所述保护氨基酸N端采用Fmoc保护，所述树脂为2
‑
氯三苯基氯树脂。
[0010]本专利技术的再一目的是提供一种蚯蚓多肽的制备方法，所述蚯蚓多肽包含肽段F1
‑
2和F1
‑
3，F1
‑
2的氨基酸序列为EGKDEFRL，F1
‑
3的氨基酸序列为EIRIKHADRK，所述多肽以蚯蚓为原料制备得到，包括如下步骤：
[0011](1)制备蚯蚓酶解液：取蚯蚓将其腹部剖开、冲洗干净，将处理后的蚯蚓匀浆、冷冻干燥，得到冻干粉；取蚯蚓冻干粉溶解于去离子水中，加入酶进行酶解，制得蚯蚓酶解液；
[0012](2)制备蚯蚓多肽粗提物：取步骤(1)制得的蚯蚓酶解液，加入无水乙醇至混合溶
液中乙醇终浓度为30～60wt％，室温静置12～24小时；低温条件下1000～5000rpm离心10
‑
30分钟，取上清液抽滤获取滤液，将滤液低温减压浓缩，得蚯蚓多肽粗提物溶液；
[0013](3)制备蚯蚓多肽超滤干粉：将步骤(2)制得的蚯蚓多肽粗提物溶液采用超滤法进行截留分段，获得不同分子量段的蚯蚓多肽组分；所述截留分段方法为使用截留分子量为3.5kDa的超滤离心管进行离心，离心转速为5000～8500rpm，干燥后获得分子量小于3.5kDa的蚯蚓多肽超滤干粉。
[0014]优选地，上述蚯蚓多肽的制备方法还包括步骤：
[0015](4)蚯蚓多肽过凝胶色谱柱进行分离纯化：将步骤(3)制得的分子量小于3.5kDa的蚯蚓多肽超滤干粉，溶解于去离子水中，微滤膜过滤；凝胶柱提前用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱，用去离子水洗脱，流速为1.5
‑
2.5mL/min，收集首先出峰的洗脱峰样品，冷冻、干燥，获得纯化后的多肽的冻干粉。
[0016]优选地，上述蚯蚓多肽的制备方法中，步骤(1)中加入木瓜蛋白酶进行酶解：酶解温度为40～70℃，酶量为每克冻干粉加酶1000～10000U，酶解时间为2～6小时，制得蚯蚓酶解液。
[0017]优选地，上述蚯蚓多肽的制备方法中，步骤(4)中所述凝胶色谱柱为Sephadex G
‑
25凝胶柱，所述微滤膜的孔径为0.22μm。
[0018]本专利技术的最后目的是提供上述的抗氧化活性多肽的制备方法或上述的蚯蚓多肽的制备方法制备的多肽在制备抗氧化和/或延缓衰老的药物、食品添加剂、保健品或护肤品方面的应用。
[0019]优选地，所述的应用的技术方案中，所述多肽用于清除DPPH自由基。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]1、传统研究认为蚯蚓蛋白等大分子物质的生物活性更高，而本专利技术通过分子过滤、凝胶色谱纯化确定小分子蚯蚓多肽抗氧化及抗衰活性更高，并且采用LC
‑
MS/MS从蚯蚓多肽中鉴定出几个特定的片段，并确定了2种活性突出的蚯蚓多肽片段，该多肽片段有可能是蚯蚓多肽体内发挥生物作用的重要物质基础。
[0022]2、本专利技术从蚯蚓多肽中鉴定出两种氨基酸序列确定的生物活性肽段，经验证具有显著的抗氧化及延缓衰老的作用，其DPPH自由基清除率非常高，动物(秀丽线虫)实验显示其能缓解由氧化应激引发的早衰，可用于制备具有抗氧化和延缓衰老作用的药物、保健品、食品添加剂或护肤品中，有很好的应用前景。
[0023]3、蚯蚓本身富含蛋白质，干蚯蚓蛋白含量高可达60％以上，是自然界中蛋白质含量最高的动物之一，而多肽源自于蛋白质，高蛋白决定了蚯蚓多肽的得率会很高，其次蚯蚓易于养殖，相比于鲎、鲨鱼皮、泽蛙等动物来源，其综合成本更低。
[0024]4、本专利技术以蚯蚓为原料制备本专利技术的抗氧化活性多肽，能避免人工合成所可能引起的副作用，是一种天然的抗氧化剂，无使用安全问题，且蚯蚓容易养殖，能够大规模饲养获得，原料来源丰富，一方面保证安全性，另一方面充分利用自然资源，减少生产成本。
附图说明
[0025]图1是蚯蚓多肽＞8kDa、3.5
‑
10kDa和＜3.5kDa三种不同分子量段超滤样品抗氧化活性测试(DPPH体外模型)结果。
[0026]图2是蚯蚓多肽＞8kDa、3.5
‑
10kDa和＜3.5kDa三种不同分子量段超滤样品延缓衰老活性测试(秀丽线虫动物模型)结果。
[0027]图3是蚯蚓多肽过G
‑
25凝胶色谱图。
[0028]图4是分子量＜3.5kDa段的蚯蚓多肽过G
‑
25凝胶色谱柱洗脱纯化样品抗氧化活性测试(DPPH体外模型)结果。
[0029]图5是分子量＜3.5kDa段蚯蚓多肽过G
‑
25凝胶色谱柱洗脱纯化样品延缓衰老活性测试(秀丽线虫动物模型)结果。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化活性多肽，其特征在于：所述多肽为F1
‑
2或者F1
‑
3，F1
‑
2的氨基酸序列为EGKDEFRL，F1
‑
3的氨基酸序列为EIRIKHADRK。2.权利要求1所述的抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于：采用人工合成方法制备。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述人工合成方法为Fmoc多肽固相合成法。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：按照所述活性多肽C端到N端的氨基酸顺序进行逐一的固相合成，具体合成方法如下：按照氨基酸顺序，将保护氨基酸原料和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和保护氨基酸侧链保护基，获得粗品，粗品纯化后获得所述蚯蚓合成多肽；所述保护氨基酸N端采用Fmoc保护，所述树脂为2
‑
氯三苯基氯树脂。5.一种蚯蚓多肽的制备方法，其特征在于：所述蚯蚓多肽包含肽段F1
‑
2和F1
‑
3，F1
‑
2的氨基酸序列为EGKDEFRL，F1
‑
3的氨基酸序列为EIRIKHADRK，所述多肽以蚯蚓为原料制备得到，包括如下步骤：(1)制备蚯蚓酶解液：取蚯蚓将其腹部剖开、冲洗干净，将处理后的蚯蚓匀浆、冷冻干燥，得到冻干粉；取蚯蚓冻干粉溶解于去离子水中，加入酶进行酶解，制得蚯蚓酶解液；(2)制备蚯蚓多肽粗提物：取步骤(1)制得的蚯蚓酶解液，加入无水乙醇至混合溶液中乙醇终浓度为30～60wt％...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蓓，朱国栋，任之尧，
申请(专利权)人：广州市老人院广州市老年医院，
类型：发明
国别省市：