一种长效人重组胰高血糖素样肽-1及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种长效人重组胰高血糖素样肽

【技术实现步骤摘要】
一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1及其应用


[0001]本专利技术涉及一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1及其应用，属于基因构建


技术介绍

[0002]胰高血糖素样肽
‑
1 (GLP
‑
1) 是一种由 30 或 31个氨基酸组成的肽激素，源自胰高血糖素原肽的组织特异性翻译后加工。它由肠内分泌L细胞和孤束核内的某些神经元在食物消耗后产生和分泌。初始产物 GLP
‑
1 (1
‑
37) 易被酰胺化和蛋白水解裂解，从而产生两种截短且等效的生物活性形式，GLP
‑
1 (7
‑
36) 酰胺和 GLP
‑
1 (7
‑
37)。活性 GLP
‑
1 由两个α
‑
螺旋组成，分别位于氨基酸的13
‑
20位和24
‑
35位，被一个连接区隔开。
[0003]GLP
‑
1一旦分泌，会对蛋白水解酶二肽基肽酶4 (DPP
‑
4)的催化活性极为敏感。具体来说，DPP
‑
4 可以裂解GLP
‑
1 Ala8‑
Glu
9 之间的肽键，导致形成丰富的 GLP
‑
1 (9
‑
36) 酰胺，其在循环中总 GLP
‑
1 的占比可达 60
‑
80%。DPP
‑
4 在多种组织和细胞类型中广泛表达，并以膜锚定和可溶性循环形式存在。更值得注意的是，DPP
‑
4 在内皮细胞表面表达，包括与 GLP
‑
1 分泌位点直接相邻的细胞。
[0004]GLP
‑
1 具有多种生理特性，使其（及其功能类似物）成为深入研究的主题，其可作为糖尿病潜在的治疗方法，可以使糖尿病病情得到长期改善并具有直接的效果。它具有通过增强胰岛素分泌以葡萄糖依赖性方式降低血糖水平的能力。除了促胰岛素作用外，GLP
‑
1 还与许多调节和保护作用有关。与 GIP（抑胃肽） 不同，GLP
‑
1 的作用在Ⅱ型糖尿病患者中得以保留，因此大量药物研究已针对开发基于 GLP
‑
1 的治疗。
[0005]内源性 GLP
‑
1 主要被DPP
‑
4以及中性内肽酶和肾脏清除迅速降解，半衰期约为2分钟。因此，只有10
‑
15%的GLP
‑
1完好无损地进入循环，导致空腹血浆水平仅为0
‑
15 pmol/L。为了克服这个问题，已经开发了 GLP
‑
1 受体激动剂和 DPP
‑
4 抑制剂来增加 GLP
‑
1 活性。与胰岛素和磺脲类等常见治疗药物相反，基于 GLP
‑
1 的治疗与体重减轻和低血糖风险降低有关，这是
ꢀⅡꢀ
型糖尿病患者的两个重要考虑因素。
[0006]GLP
‑
1 最值得注意的作用是其以葡萄糖依赖性方式促进胰岛素分泌的能力。由于 GLP
‑
1 与胰腺 β 细胞上表达的 GLP
‑
1 受体结合，受体与 G 蛋白亚基偶联并激活腺苷酸环化酶，从而增加 ATP 生成 cAMP。随后，包括 PKA 和 Epac2 在内的二级通路的激活改变了离子通道活性，导致细胞溶质Ca
2+
水平升高，从而增强了胰岛素颗粒的胞吐作用。在此过程中，葡萄糖的流入可确保有足够的ATP 来维持刺激作用。
[0007]本专利技术通过对野生型GLP
‑
1进行变异改造和连接人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽（CTP）来设计新的长效 GLP
‑
1 变体。先前已批准将 CTP 连接到蛋白质的编码序列导致体内半衰期增加。此外，CTP显示在人类中不具有免疫原性。

技术实现思路

[0008]为了解决上述的技术问题，本专利技术提供一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1及其制
备方法和应用，通过先采用将野生型GLP
‑
1进行变异改造，将野生型GLP
‑
1多肽中第8位的丙氨酸（Ala8）改造成甘氨酸（Gly8），后续采用将HCGβ羧基末端肽（CTP）的序列连接到变异型GLP
‑
1的编码序列的手段，将一个或多个CTP序列连接到变异型GLP
‑
1的C端或/和N端来设计GLP
‑
1变体。
[0009]本专利技术提供一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1包含一个或多个CTP序列可以连接到GLP
‑
1的N端或/和C端。
[0010]所述的GLP
‑
1野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的GLP
‑
1变异型的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1的构建方法为：使用基因合成技术构造胰高血糖素样肽
‑
1（GLP
‑
1）的嵌合基因含有一个或多个CTP序列，其中CTP序列Ⅰ）一个在C端,
ꢀⅡ
)一个在N端 ,
ꢀⅢ
)两个在C端,
ꢀⅣ
) 两个在N端，
Ⅴ
）两个其中一个在N端，另外一个在C端，
Ⅵ
）三个在C端，
Ⅶ
)三个在N端,
ꢀⅧ
) 三个其中一个在N端，另外两个在C端,
ꢀⅨ
）三个其中两个在N端，另外一个在C端，这些嵌合基因将被测序并克隆到真核表达载体中，将构建的含有GLP
‑
1和CTP序列的载体转染到CHO细胞中，选择稳定的克隆，收集稳定克隆的培养基，纯化GLP
‑
1变体。
[0011]本专利技术进一步保护上述长效人重组促胰高血糖素样肽
‑
1在制备治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖症药物中的应用。
[0012]本专利技术具有如下有益效果：开发一种长效人胰高血糖素样肽
‑
1，通过HCGβ羧基末端肽（CTP）的序列连接到突变型胰高血糖素样肽
‑
1的编码序列的手段。通过将一个或多个CTP序列连接到GLP
‑
1的C端或/和N端来设计类似物。
[0013]GLP
‑
1 CTP类似物被转染到CHO细胞，选择稳定的GLP
‑
1 CTP类似物克隆。对所选GLP
‑
1 CTP类似物的生物活性在体内和体外进行测试。
[0014]含有G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1，其特征在于：将野生型GLP
‑
1进行变异改造，使其不被DPP
‑
4酶剪切，将包含一个或多个CTP的序列连接到变异型GLP
‑
1的N端或/和C端；所述的GLP
‑
1野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的GLP
‑
1变异型的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种基于权利要求1所述的长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1的制备方法，其特征在于：具体方法为：使用基因合成技术构造变异型人胰高血糖素样肽
‑
1（GLP
‑
1）的嵌合基因含有HCGβ羧基末端肽（CTP）的序列，其中CTP可以Ⅰ）一个在C端；Ⅱ）一个在N端；Ⅲ）两个在C端；Ⅳ) 两个在N端；
Ⅴ
）两个其中一个在N端，另外一个在C端；
Ⅵ
）三个在C端；
Ⅶ
）三个在N端；
Ⅷ
）三个其中一个在N端，另外两个在C端；
Ⅸ
）三个其中两个在N端，另外一个在C端，这些嵌合基因将被测序并克隆到真核表达载体中，将构建的含有GLP
‑
1和CTP序列的载体转染到CHO细胞中，然后选择稳定的克隆，收集稳定克隆的培养基，纯化GLP
‑
1 变体。3.根据权利要求2所述的一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1的制备方法，其特征在于，所述变异型嵌合基因的构建包括如下步骤：（S1）构建GLP
‑1‑
CTP；（S2）构建GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP；（S3）构建GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP
‑
CTP；（S4）构建CTP
‑
GLP
‑
1；（S5）构建CTP
‑
CTP
‑
GLP
‑
1；（S6）构建CTP
‑
CTP
‑
CTP
‑
GLP
‑
1；（S7）构建CTP
‑
GLP
‑1‑
CTP；（S8）构建CTP
‑
GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP；（S9）构建CTP
‑
CTP
‑
GLP
‑1‑
CTP。4.根据权利要求3所述一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1的制备方法，其特征在于：所述的步骤（S1）包括如下步骤：所述的GLP
‑1‑
CTP是HCGβ序列和GLP
‑
1序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含GLP
‑
1序列的后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3
′
端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP
‑
1基因作为模板，引物3包含GLP
‑
1 序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含GLP
‑
1序列的后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码的反义基码；（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP
‑1‑
CTP；所述的步骤（S2）包括如下步骤：所述的GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP是HCGβ序列和GLP
‑1‑
CTP序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含CTP 3
′
端序列后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3
′
端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP
‑1‑
CTP基因作为模板，引物3包含GLP
‑
1 序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含CTP 3
′
端序列后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码的反义基码；（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP；所述的步骤（S3）包括如下步骤：所述的GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP
‑
CTP是HCGβ序列和GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含CTP 3
′
端序列后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3
′
端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP基因作为模板，引物3包含GLP
‑
1序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含CTP 3
′
端序列的后4个基码和CTP 5
′
端序列的前4个基码的反义基码；（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP
‑1‑
CTP
‑
CTP
‑
CTP。
5.根据权利要求3所述一种长效人重组胰高血糖素样肽
‑
1的制备方法，其特征在于：所述的步骤（S4）包括如下步骤：所述的CTP
‑
GLP
‑
1是HCGβ序列和GLP
‑
1序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含CTP 5
′
端序列的前4个基码和一个限制位点，引物2包含CTP 3
′
端序列的后4个基码和GLP
‑
1序列的前4个基码的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP
‑
1基因作为模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴萨姆法瑞斯，
申请(专利权)人：上海延立药业有限公司，
类型：发明
国别省市：