一种具有自产氧能力的DNA纳米酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种具有自产氧能力的DNA纳米酶及其制备方法与应用，包括DNA纳米花、血红素辅酶和光敏剂Ce6，DNA纳米花由引物链和底物链通过滚环扩增形成，DNA纳米花在高钾的Tris缓冲液中形成AS1411G四链体空间结构，将血红素辅酶嵌入至AS1411G四链体结构中，光敏剂Ce6通过π

【技术实现步骤摘要】
一种具有自产氧能力的DNA纳米酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及纳米材料和纳米生物医药领域，具体涉及一种具有自产氧能力的DNA纳米酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]癌症是影响人类生命健康和社会发展的重大问题。化学疗法作为临床上治疗癌症的主要手段，但肿瘤微环境的异质性和单一化疗造成低疗效、严重不良反应并形成肿瘤耐药性。因光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)具有可控性好、毒性低和微创性等优点，从而避免高剂量诱导的不良反应和肿耐药性。
[0003]然而，PDT在实际应用中存在一些障碍。由于肿瘤细胞增殖异常、血管结构缺失及肿瘤组织血流不足，肿瘤微环境常表现为低氧、弱酸性及过表达的过氧化氢、细胞因子等特点。肿瘤乏氧上调肿瘤缺氧诱导因子
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1α(HIF
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1α)的表达水平，导致肿瘤细胞对化疗、PDT等疗法产生耐药性。光敏剂转化氧气为具有细胞毒性的活性氧(ROS)进行光动力治疗，从而加剧肿瘤乏氧程度且严重影响ROS生成效率，最终导致PDT疗效低和预后不良。此外， ROS通过结合DNA、脂质等生物大分子，引起细胞器功能障碍及损伤，最终导致肿瘤细胞死亡。因ROS的半衰期较短(<200ns)以及扩散范围较小(20nm)，定位于细胞器的ROS比在细胞膜或细胞质内的更具肿瘤杀伤能力，因此保证光敏剂有效的传递是实现光动力疗效的重要条件。
[0004]为解决肿瘤缺氧，已发展多种供氧策略以提高肿瘤组织的氧气水平。通过递送全氟化碳、血红蛋白或者红细胞膜等携氧材料，可直接改善肿瘤乏氧情况。然而，这些递氧材料通常存在携氧能力差、稳定性差，如血红蛋白半衰期短等缺陷，导致制剂递氧效率低。而响应肿瘤微环境的自产氧策略恰能解决此类问题，靶向递送过氧化氢酶、二氧化锰纳米粒、片及普鲁士蓝纳米粒等具有催化活性的酶和纳米材料，分解肿瘤细胞内过表达的H2O2，上调胞内氧气水平，进而提高光动力疗效，且在肿瘤缺氧治疗中疗效显著。但以上制剂均存在应用限制： (1)过氧化氢酶在体内存在不同程度的失活；(2)纳米材料组成成分不可控性和生物安全性。因此，构建安全高效的递送载体，在实现光敏剂靶向递送的同时解决肿瘤乏氧问题，是实现光动力治疗研究领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种具有自产氧能力的DNA纳米酶及其制备方法与应用，其目的是为了构建一种安全高效的递送载体，将过血红素辅酶和光敏剂高效组合成为纳米材料，能够实现体内稳定的靶向肿瘤组织，并且能在肿瘤细胞处有效释放、协同作用，改善肿瘤微环境乏氧情况，提高肿瘤光动力治疗的效果。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种具有自产氧能力的DNA纳米酶，包括DNA纳米花、血红素辅酶和光敏剂Ce6，所述DNA纳米花由引物链和底物链通过滚环扩增形成，所述引物链如SEQ ID NO.1所示：
[0007]GTGGTGGTGTTGGTGGTGGT；
[0008]所述底物链如SEQ ID NO.2所示：
[0009]CCACCAACACCACCACCACCTTTGACACACTAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCG TACGATATGCCAGTGTGTCTTTCCACCA；
[0010]所述DNA纳米花具有AS1411 G四链体结构，所述血红素辅酶嵌入至AS1411 G四链体结构中，所述光敏剂Ce6通过π
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π作用堆叠在AS1411 G四链体结构中。
[0011]作为优选，所述DNA纳米酶的形状为球形，粒径为100～200nm。
[0012]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供了一种具有自产氧能力的DNA纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1、制备DNA纳米花：将底物链和引物链混合，经退火进行互补配对形成带缺口的环状DNA，然后加入DNA连接酶反应形成一个完整的环状DNA，最后引入DNA聚合酶进行 PCR扩增，形成若干个拷贝链的DNA长链，DNA长链通过碱基配对和自组装方式合成DNA 纳米花；
[0014]S2、AS1411 G四链体结构形成：取DNA纳米花溶于含高钾离子的Tris缓冲液中，室温孵育，形成带AS1411 G四链体空间结构的DNA纳米花；
[0015]S3、组装形成DNA纳米酶：将步骤S2制得的带AS1411 G四链体空间结构的DNA纳米花与血红素辅酶混合、室温孵育4～6h，然后加入光敏剂Ce6涡旋混匀，继续室温孵育3～4 h,离心收集沉淀即得具有自产氧能力的DNA纳米酶。
[0016]作为优选，所述步骤S1中退火温度为95℃水浴10～30min，然后缓慢降温至25℃，所述降温时间大于2.5h。
[0017]作为优选，所述步骤S1中DNA连接酶为T4
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DNA连接酶，所述DNA聚合酶为phi29 DNA 聚合酶。
[0018]作为优选，所述步骤S2中Tris缓冲液为Tris
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HCl、NaCl和KCl混合液，pH为7～8。
[0019]作为优选，所述步骤S3中DNA纳米花与血红素辅酶的混合摩尔比为1:40～50；所述DNA 纳米花与光敏剂Ce6的混合摩尔比为1:500～600。
[0020]一种如权利要求1～2任一项所述的具有自产氧能力的DNA纳米酶或者如权利要求3～7 任一项所述制备方法制得的具有自产氧能力的DNA纳米酶在制备抗肿瘤光动力治疗药物中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022]1、本专利技术提供的DNA纳米酶高效稳定负载血红素辅酶和光敏剂Ce6，通过EPR效应富集于肿瘤组织，其中AS1411 G四链体识别高表达核仁素的肿瘤细胞实现靶向定位；在肿瘤中高过氧化氢的环境下，血红素辅酶高效催化产氧，显著缓解肿瘤微环境乏氧的情况；同时光敏剂可以将产生的氧转化为具有肿瘤细胞毒性的活性氧ROS，进一步对肿瘤细胞进行杀伤，血红素辅酶与光敏剂协同作用，显著增强肿瘤光动力治疗的效果；
[0023]2、该DNA纳米酶中的DNA纳米花的关键结构为AS1411 G
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四链体，G
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四链体由富含鸟嘌呤(G)的寡核酸链通过四个相邻鸟嘌呤碱基间氢键连接形成，其中，血红素辅酶可嵌入至芳香族平面中，形成具有过氧化氢酶活性的DNA酶，催化肿瘤组织中富含的过氧化氢，产生氧气；与此同时，光敏剂Ce6可通过π
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π作用堆叠在其芳香族平面，从而实现将血红素辅酶和光敏剂Ce6稳定负载于DNA纳米花结构中，形成稳定性良好的DNA纳米酶，并利用 AS1411G
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四链体对肿瘤的高特异性识别，实现肿瘤靶向递送；
[0024]3、该DNA纳米酶具有良好的抗酶降解性能，能够实现体内的稳定递送并靶向肿瘤
细胞，对心、肝、脾、肺、肾等无明显副作用，具有良好的生物安全性；
[0025]4、该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有自产氧能力的DNA纳米酶，其特征在于，包括DNA纳米花、血红素辅酶和光敏剂Ce6，所述DNA纳米花由引物链和底物链通过滚环扩增形成，所述引物链如SEQ ID NO.1所示：GTGGTGGTGTTGGTGGTGGT；所述底物链如SEQ ID NO.2所示：CCACCAACACCACCACCACCTTTGACACACTAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCAGTGTGTCTTTCCACCA；所述DNA纳米花具有AS1411 G四链体结构，所述血红素辅酶嵌入至AS1411 G四链体结构中，所述光敏剂Ce6通过π
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π作用堆叠在AS1411 G四链体结构中。2.根据权利要求1所述的具有自产氧能力的DNA纳米酶，其特征在于，所述DNA纳米酶的形状为球形，粒径为100～200nm。3.一种如权利要求1～2任一项所述具有自产氧能力的DNA纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备DNA纳米花：将底物链和引物链混合，经退火进行互补配对形成带缺口的环状DNA，然后加入DNA连接酶反应形成一个完整的环状DNA，最后引入DNA聚合酶进行PCR扩增，形成若干个拷贝链的DNA长链，DNA长链通过碱基配对和自组装方式合成DNA纳米花；S2、AS1411 G四链体结构形成：取DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄术，袁军，周文虎，
申请(专利权)人：湖南省人民医院湖南师范大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：