一种AFDN报告系统及其应用技术方案

本申请公开了一种AFDN报告系统，包含AFDN基因片段和报告基因片段，所述AFDN基因片段序列为SEQ NO.:1。通过本发明专利技术的方法可提高对AFDN基因片段的克隆成功率，本发明专利技术的AFDN报告系统可有效应用于AFDN作用因子和药物的筛选，进而提供相应的食道癌治疗方案和药物。进而提供相应的食道癌治疗方案和药物。进而提供相应的食道癌治疗方案和药物。

【技术实现步骤摘要】
一种AFDN报告系统及其应用


[0001]本申请属于基因工程领域，具体而言，涉及一种AFDN报告系统及其应用。

技术介绍

[0002]食管癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，死亡率居世界第六位，国内尤以华南地区高发，严重威胁国民的健康和生命。在我国，90％以上是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。由于食管癌早期临床症状隐匿，许多患者诊断时已是晚期，肿瘤已发生浸润和转移，其临床治疗效果差，五年生存率仅为20％。因此，探索食管癌发生、发展的分子机制对于寻找早期诊断标志物以及研发有效的靶向药物具有重要的科学和临床应用价值。
[0003]申请人前期研究发现，人AFDN(afadin,adherens junction formation factor)基因在食管癌组织中的表达比癌旁组织中的表达显著降低，因此推测人AFDN基因是潜在的食管癌诊断标志物和治疗靶点。
[0004]报告基因(Reporter Gene)是指可编码某种容易检测的、能与内源性背景蛋白相区别的蛋白或酶的基因，研究者可通过报告基因的表达产物来明确目的基因的表达情况。荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性的一种报告系统，其中萤火虫荧光素酶为报告基因。其原理是荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化性荧光素(oxyluciferin)，在此过程中会发出生物荧光(bioluminescence)，通过测量荧光强度可明确荧光素酶活性，从而确定目的基因表达情况。
[0005]荧光素酶报告基因已广泛应用于检测非编码RNA(non
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coding RNA，ncRNA)、转录因子和药物对目的基因启动子转录活性的调控，RNA、蛋白和药物对目的基因mRNA稳定性、翻译以及目的基因蛋白稳定性的调控。本专利技术构建的人AFDN基因编码序列荧光素酶报告基因质粒可应用于探索影响人AFDN mRNA稳定性、翻译以及人AFDN蛋白稳定性的RNA、蛋白和药物，因此需要把人AFDN基因编码序列克隆到荧光素酶表达序列前方(非启动子区域)。由于人AFDN基因编码序列较长，限制了酶切位点的选择。此外，人AFDN基因编码序列较长也会导致克隆成功率较低。
[0006]针对上述AFDN基因的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现思路

[0007]针对上述问题，一方面，本专利技术提供一种AFDN报告系统，包含AFDN基因片段和报告基因片段，所述AFDN基因片段序列为SEQ NO.:1。所述报告基因可选自荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β
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半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氢叶酸还原酶基因等中的一种或多种。所述报告系统可为表达载体，含有使目的基因和报告基因得以表达的启动子、增强子、终止子、抗性筛选标记等基因元件。
[0008]在一种实施方式中，所述报告基因为荧光素酶基因。
[0009]在一种实施方式中，所述AFDN报告系统的序列为SEQ NO.:2。
[0010]另一方面，本专利技术提供一种AFDN报告系统的构建方法，包括：以人AFDN基因序列为模板，用引物对SEQ NO.:3和4进行扩增，得到序列为SEQ NO.:1的目的基因片段，回收并纯化；酶切序列为SEQ NO.:1的目的基因片段和载体，连接，转化克隆，提取质粒并纯化，得到所述AFDN报告系统，所述载体的序列含有所述报告基因的序列。通过本专利技术的方法可大大提高AFDN基因片段的克隆效率。
[0011]可选地，所述载体为pmirGLO质粒。
[0012]可选地，所述目的基因片段与所述载体的摩尔比为4:1。
[0013]本专利技术还提供AFDN报告系统在用于检测候选因子对AFDN表达的调控活性中的应用。
[0014]本专利技术还提供一种检测候选因子对AFDN表达的调控活性的方法，包括将所述AFDN报告系统与含有所述候选因子的表达载体转染食管癌细胞，检测报告基因的表达。
[0015]本专利技术还提供AFDN报告系统在基于AFDN的分子靶向药物筛选中的应用。
[0016]本专利技术还提供一种基于AFDN的分子靶向药物筛选方法，包括：
[0017]将所述AFDN报告系统转染食管癌细胞，
[0018]用测试物质处理所述细胞后检测报告基因的表达来明确测试物质是否靶向调控AFDN。
[0019]利用本专利技术的AFDN报告系统能够有效地进行AFDN相关作用因子或药物筛选，从而为阐述食管癌发生和发展的分子机制以及寻找靶向AFDN药物提供有效的试验基础。
附图说明
[0020]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0021]图1是本专利技术AFDN报告系统质粒示意图；
[0022]图2是荧光素酶活性检测。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0025]除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本专利技术的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方
法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
[0026]实施例1 AFDN报告系统构建
[0027](1)以人AFDN基因基因序列为模板，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增人AFDN基因编码序列SEQ NO.:1，其5
’
端含XhoI酶切位点，3
’
端含XbaI酶切位点。所用引物如下：SEQ NO.:3(AFDN 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AFDN报告系统，其特征在于，包含AFDN基因片段和报告基因片段，所述AFDN基因片段序列为SEQ NO.:1。2.根据权利要求1所述的AFDN报告系统，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶基因。3.根据权利要求1所述的AFDN报告系统，其特征在于，所述AFDN报告系统的序列为SEQ NO.:2。4.权利要求1
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3任一项所述的AFDN报告系统的构建方法，其特征在于，包括：以人AFDN基因序列为模板，用引物对SEQ NO.:3和4进行扩增，得到序列为SEQ NO.:1的目的基因片段，回收并纯化；酶切序列为SEQ NO.:1的目的基因片段和载体，连接；转化克隆，提取质粒并纯化，得到所述AFDN报告系统；所述载体的序列含有所述报告基因的序列。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述载体为pmirGLO质粒。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷艺炎，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：