一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测试剂盒的技术领域，具体涉及一种基于MB

【技术实现步骤摘要】
一种基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒检测试剂盒的
，具体涉及一种基于 MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)主要通过呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感；该病毒感染具有潜伏期(1
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14天)，感染潜伏期的病人一般无症状，但已经具备很强的传染性。相比新冠病毒原始株，奥密克戎变异株表面的刺突蛋白(spike protein，又称S蛋白)发生了30多种变化，S蛋白通过识别并结合宿主细胞上的受体入侵细胞，S蛋白也是免疫反应中被抗体攻击的主要目标。其中N501Y，E484K，以及K417N 突变在奥密克戎株上为多发突变，可以作为判断的标志。针对新冠病毒检测阳性的病例，确认是否属于新冠病毒奥密克戎突变株，对于病毒监测具有重要意义。目前，新型冠状病毒实验室检测最主要的方法是实时荧光RT
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PCR方法，主要针对新型冠状病毒基因组中开放阅读框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白区(N)区保守基因，来判断待检标本是否含有新冠病毒基因。但是，这种real
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time RT
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PCR试剂盒只可判断待检标本是否为新冠病毒感染，而不能对病毒型别进行分型检测，进而判断是否为奥密克戎突变株。目前对新型冠状病毒的型别鉴定，主要通过对病毒进行全基因组测序和分析来完成。但全基因组测序要求具备基因测序仪等相关设备，加上对人员要求高，不能满足基层工作需要。
[0003]多重PCR是在一个反应体系里加入多对特异性引物，针对多个模板或同个模板的不同区域扩增出多个目的片段的PCR技术。一个理想的多重PCR体系，并非是单一PCR的简单混合，而是需要选择各个高度特异性的目的片段和不互相影响各引物对，能够利用同样的扩增条件和试剂达到同时扩增出目的片段的PCR技术，引物对的序列选择、目的片段的选择、PCR扩增条件和试剂的调试优化都是多重PCR技术的难点。
[0004]分子信标(molecular beacon，MB)是1996年Tyagi等专利技术的一种有茎环结构的荧光探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。综上所述，基于碱基互补配对原则来识别特定核酸序列是特异性检测的一种有效方法，急需开发出利用分子信标探针在不同温度下发出荧光强度的差异对PCR扩增产物进行检测方法，进而进行分型的方法。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用，相比传统技术，克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性
差的缺陷。
[0006]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0007]本专利技术提供了一种基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，所述试剂盒包括针对N基因的第一引物对和第一分子信标探针，针对N501Y基因的第二引物对和第二分子信标探针，针对E484K基因的第三引物对和第三分子信标探针，针对K417N基因的第四引物对和第四分子信标探针；
[0008]所述第一引物对的核酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO.3；
[0009]所述第二引物对的核酸序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，所述第二分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO.6；
[0010]所述第三引物对的核酸序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO.9；
[0011]所述第四引物对的核酸序列为SEQIDNO.10和SEQIDNO.11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQIDNO.12；
[0012]所述第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针的5
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端连接有荧光发光基团，且3
’
端连接有荧光猝灭基团；
[0013]所述荧光发光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine6G、OrengonGreen488、OrengonGreen500、OrengonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、ROX的一种以上；
[0014]所述荧光猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ
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1、BHQ
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2、BHQ
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3的一种以上；
[0015]所述试剂盒还包括高保真性Taq聚合酶、尿嘧啶
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N
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糖基化酶、逆转录酶、PCR增强剂以及MB
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RT
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PCRBuffer，优选为尿嘧啶
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N
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糖基化酶，其能够大大降低试剂被环境污染的风险，操作非常安全，结果可信度也大大增加；
[0016]所述高保真性Taq聚合酶能够保证扩增产物的碱基错配率在测序允许的标准范围内；
[0017]所述尿嘧啶
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N
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糖基化酶能在25℃下将前期不小心引入的扩增产物中尿嘧啶切断，使其不能成为扩增模板，尿嘧啶
‑
N
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糖基化酶在95℃下失活，不影响接下来人DNA作为模板的扩增，从而有效预防由PCR产物的污染导致的假阳性结果；
[0018]所述试剂盒还包括MB
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RT
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PCR反应液和酶混合物；
[0019]所述酶混合物包括TaqDNA聚合酶、高热稳定性的M
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MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂；
[0020]所述MB
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RT
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qPCR反应液包括RT
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PCR缓冲液、PCR增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；
[0021]所述PCR缓冲液包括Tris
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HCl(pH8.0)、硫酸铵、氯化钾和TritonX
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100；
[0022]所述PCR增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对N基因的第一引物对和第一分子信标探针，针对N501Y基因的第二引物对和第二分子信标探针，针对E484K基因的第三引物对和第三分子信标探针，针对K417N基因的第四引物对和第四分子信标探针。2.根据权利要求1所述的基于MB
‑
RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.3。3.根据权利要求1所述的基于MB
‑
RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，所述第二分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.6。4.根据权利要求1所述的基于MB
‑
RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.9。5.根据权利要求1所述的基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.12。6.根据权利要求1所述的基于MB
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RT
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PCR检测新型冠状病...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂传明，
申请(专利权)人：广州奕昕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：