孔板和包括所述孔板的3D细胞培养板制造技术

本发明专利技术提供了一种孔板和包括所述孔板的3D细胞培养板，所述孔板包括：具有重复图案的孔结构，每个孔结构在主孔和子孔之间连续设置有空间部以注入细胞培养液，所述子孔包括培养细胞的凹入部，其中，所述主孔连接到所述空间部并形成台阶，所述子孔连接到所述空间部并形成倾斜表面。成倾斜表面。成倾斜表面。

【技术实现步骤摘要】
孔板和包括所述孔板的3D细胞培养板
[0001]本申请是申请日为2020年06月25日，申请号为202080057825.0，专利技术名称为“不使用水凝胶大量增殖干细胞的方法”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种孔板和包括所述孔板的3D细胞培养板。更具体地，本专利技术涉及用于生产尺寸均匀的类器官的孔板和包括所述孔板的3D细胞培养板。

技术介绍

[0003]将已分化的体细胞恢复为未分化状态的细胞(例如干细胞)的过程称为重编程。诱导性多能干细胞(iPSC)也称为逆向分化的干细胞和逆向分化的多能干细胞，重编程是使用重编程因子(Oct4、Klf4、Sox2、c
‑
Myc等)将体细胞转化为干细胞(非专利文献1和2)。
[0004]诱导性多能干细胞在诸如细胞治疗剂、生物组织工程、新药开发、毒理学和精准医学等领域具有广泛的应用。这些应用需要培养大量高效、高质量的诱导性多能干细胞和胚胎干细胞，并且要求在相同效率的情况下，干细胞大小均一，但事实上，对这种大量生产技术的研究还不够充分。此外，迄今为止，重编程诱导性多能干细胞的效率也相当低。近来对临床应用的方法进行了很多研究，即不整合外源基因的方法，也即不实现DNA整合的方法，其中尝试通过例如游离型载体等方法来生产诱导性多能干细胞，但是这一系列生产方法存在3D培养方法的效率和体细胞的重编程效率也较低的问题。
[0005]此外，对于诱导性多能干细胞重编程，将2D细胞培养板底部涂覆水凝胶并使用，但很少形成集落，即使在细胞重编程后形成集落，集落也不易分离，这不仅对研究目的来说是障碍，而且对商业化来说也是障碍。此外，由于在现有方法的情况下几乎不可能生产大量克隆，因此难以稳定地确保在通过现有方法重编程为诱导性多能干细胞的状态下的克隆。此外，还需要一种能够轻松筛选诱导性多能干细胞的平台。
[0006]同时，韩国专利第10
‑
1756901号(专利文献1)公开了一种能够培养3D组织细胞的细胞培养芯片。在专利文献1的细胞培养芯片中，第1培养部、第2培养部和第3培养部在各层中形成，并且能够在各层确认细胞增殖的进展程度。但是，专利文献1的细胞培养芯片存在不能以高收率获得球状体和/或类器官的问题。
[0007]此外，存在在进行细胞培养的过程中更换培养液的移液作业的情况，在能够进行3D细胞培养的Corning球状体微孔板的情况下，细胞培养中的球状体或类器官会受到影响，使得因为存在在移液作业的过程中球状体或类器官会被吸起或位置发生变化的情况，而存在不利于细胞培养环境的问题。
[0008]基底胶(Matrigel)(BD Bioscience的产品名)是从Engelbreth
‑
Holm
‑
Swarm(EHS)小鼠的肉瘤细胞中提取的蛋白质复合物，含有诸如层粘连蛋白、胶原蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的胞外基质(ECM)，以及诸如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EFG)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)和血小板衍生生长因子(PDGF)的生长因子。形成基底胶的复合物通过提供在许多组织中发现的复杂的胞外环境而被用作细胞培养
的基质。
[0009]由于基底胶来源于小鼠肉瘤，因此存在转移免疫原和病原体的高风险。此外，虽然基底胶用于细胞生长和组织形成，但也有批评认为，由于基底胶是一种复杂的材料，因此细胞再现性存在很大问题。目前还不清楚基底胶是否只是充当被动3D支架，为生长中的球状体提供物理支持，或者基底胶是否通过提供生物学必需要素而主动影响球状体的形成。此外，基底胶也很昂贵。因此，虽然基底胶是对细胞培养
的发展做出贡献的材料，但也存在基底胶阻碍该
发展的事实。
[0010]因此，本专利技术人在不使用水凝胶的情况下对通过提高干细胞的重编程效率以大量培养干细胞的技术进行了持续研究，从而完成了本专利技术。
[0011][相关技术文献][0012][专利文献][0013]1.韩国专利第10
‑
1756901号
[0014][非专利文献][0015]1.Takahashi K,Yamanaka S.通过确定因子由小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物诱导多能干细胞(Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors).Cell.2006；126:663
‑
676。
[0016]2.Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，Narita M，Ichisaka T，Tomoda K，Yamanaka S.通过确定因子由成人成纤维细胞诱导多能干细胞(Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors).Cell.2007；131:861
‑
872。

技术实现思路

[0017]技术问题
[0018]本专利技术的目的是提供一种干细胞增殖方法。
[0019]然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员可以通过以下描述清楚地理解未提及的其他问题。
[0020]技术方案
[0021]为实现所述目的，本专利技术提供了一种干细胞增殖方法，该方法包括：
[0022]i)培养细胞；
[0023]ii)制备用于生产干细胞的无水凝胶的3D细胞培养板；
[0024]iii)在所述无水凝胶的3D细胞培养板中将培养的细胞重编程为干细胞；
[0025]iv)形成重编程的干细胞的球状体；
[0026]v)制备用于继代培养的无水凝胶的3D细胞培养板；和
[0027]vi)通过分离球状体在所述无水凝胶的3D细胞培养板中继代培养球状体一次或多次，
[0028]其中，3D细胞培养板包括：
[0029]孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔(sub well)，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，并且
[0030]用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并
且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10
°
至60
°
的倾斜角(θ)。
[0031]细胞可以是体细胞或干细胞。
[0032]体细胞可以是成纤维细胞，但不限于此，可以使用本领域已知的任何体细胞。
[0033]干细胞可以是选自由成体干细胞、胚胎干细胞、间充质干细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种孔板，其包括：具有重复图案的孔结构，每个孔结构在主孔和子孔之间连续设置有空间部以注入细胞培养液，所述子孔包括培养细胞的凹入部，其中，所述主孔连接到所述空间部并形成台阶，所述子孔连接到所述空间部并形成倾斜表面。2.根据权利要求1所述的孔板，其中，所述台阶相对于所述主孔的壁具有10
°
至60
°
的倾斜角(θ1)。3.根据权利要求1所述的孔板，其中，所述倾斜表面相对于所述空间部的壁具有40
°
至50
°
的倾斜角(θ2)。4.根据权利要求1所述的孔板，其中，所述凹入部设置为与所述倾斜表面接触，所述子孔的上端直径为3.0mm至4.5mm，所述凹入部的上端直径为0.45mm至1.5mm，并且所述子孔的上端直径与所述凹入部的上端直径的长度比为1:0.1至1:0.5。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑锡，梁智勋，罗奎唤，田艺瑟，丁庸勋，
申请(专利权)人：株式会社下一代生物，
类型：发明
国别省市：