脑类器官的生产方法技术

本发明专利技术提供了脑类器官的生产方法。本发明专利技术提供了脑类器官的生产方法。本发明专利技术提供了脑类器官的生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脑类器官的生产方法


[0001]本专利技术涉及生产脑类器官的方法。更具体地，本专利技术涉及不使用水凝胶生产脑类器官的方法。

技术介绍

[0002]将已分化的体细胞恢复为未分化状态的细胞(例如干细胞)的过程称为重编程。诱导性多能干细胞(iPSC)也称为逆向分化的干细胞和逆向分化的多能干细胞，重编程是使用重编程因子(Oct4、Klf4、Sox2、c
‑
Myc等)将体细胞转化为干细胞(非专利文献1和2)。
[0003]在诸如阿尔茨海默病、帕金森病、脑梗塞、脑出血、脊髓损伤的神经系统疾病的治疗中，已出现了多种通过神经细胞再生的新型治疗候选材料，但筛选这些治疗候选材料的方案仍然不足。
[0004]最近开发的类器官技术采用3D培养方法。韩国专利第10
‑
1756901号(专利文献1)公开了一种能够培养3D组织细胞的细胞培养芯片。在专利文献1的细胞培养芯片中，第1培养部、第2培养部和第3培养部在各层中形成，并且能够在各层确认细胞增殖的进展程度。但是，专利文献1的细胞培养芯片存在不能以高收率获得球状体和/或类器官的问题。
[0005]此外，存在在进行细胞培养的过程中更换培养液的移液作业的情况，在能够进行3D细胞培养的Corning球状体微孔板的情况下，细胞培养物中的球状体或类器官会受到影响，使得因为存在在移液作业的过程中球状体或类器官会被吸起或位置发生变化的情况，而存在不利于细胞培养环境的问题。
[0006]基底胶(Matrigel，BD Bioscience的产品名)是从Engelbreth
‑
Holm
‑
Swarm(EHS)小鼠的肉瘤细胞中提取的蛋白质复合物，含有诸如层粘连蛋白、胶原蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的胞外基质(ECM)，以及诸如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EFG)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)和血小板衍生的生长因子(PDGF)的生长因子。形成基底胶的复合物通过提供在许多组织中发现的复杂的胞外环境而被用作细胞培养的基质。
[0007]由于基底胶来源于小鼠肉瘤，因此存在转移免疫原和病原体的高风险。此外，虽然基底胶用于细胞生长和组织形成，但也有批评认为，由于基底胶是一种复杂的材料，因此细胞再现性存在很大问题。目前还不清楚基底胶是否只是充当被动3D支架，为生长中的类器官提供物理支持，或者基底胶是否通过提供生物学必需要素而主动影响类器官的形成。此外，基底胶也很昂贵。因此，虽然基底胶是对细胞培养
的发展做出贡献的材料，但也存在基底胶阻碍该
发展的事实。
[0008]Lancaster等人已由人诱导的多能干细胞制备脑类器官(非专利文献3)。然而，由于这种脑类器官培养使用基底胶，并且是通过将脑类器官放入大型培养箱中而进行的，因此存在以下缺陷，即需要使用大量的培养基，并且大小会有所不同。另外，在以该方式生产的脑类器官的情况下，存在各种器官(大脑、中脑、视网膜等)在一个类器官中混杂、不均一、大小也不相同的问题。
[0009]因此，本专利技术人对在不使用水凝胶的情况下由诱导性多能干细胞生产脑类器官的技术进行了持续研究，从而完成了本专利技术。
[0010][相关
技术介绍
文献][0011][专利文献][0012]1.韩国专利第10
‑
1756901号
[0013][非专利文献][0014]1.Taka
h
ashi K,Yamanaka S.通过确定因子由小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物诱导多能干细胞(Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors).Cell.2006；126:663
‑
676。
[0015]2.Taka
h
ashi K，Tanabe K，Ohnuki M，Narita M，Ichisaka T，Tomoda K，Yamanaka S.通过确定因子由成人成纤维细胞诱导多能干细胞(Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors).Cell.2007；131:861
‑
872。
[0016]3.Madeline A.Lancaster，Juergen A.Knoblich，由人类多能干细胞生成脑类器官(Generation of Cerebral Organoids from Human Plurpotent Stem Cells)，Nat Protoc.2014October；9(10):2329
‑
2340。

技术实现思路

[0017]技术问题
[0018]本专利技术的一个目的是提供生产脑类器官的方法。
[0019]然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员可以通过以下描述清楚地理解未提及的其他问题。
[0020]技术方案
[0021]为实现该目的，本专利技术提供了一种生产脑类器官的方法，所述方法包括：
[0022]i)培养体细胞；
[0023]ii)制备用于生产诱导性多能干细胞的无水凝胶的3D细胞培养板；
[0024]iii)通过在所述无水凝胶的3D细胞培养板中将培养的体细胞重编程为诱导性多能干细胞来生产诱导性多能干细胞；
[0025]iv)从步骤iii)的3D细胞培养板中分离所述诱导性多能干细胞；
[0026]v)制备未涂覆水凝胶的3D细胞培养板，用于形成脑类器官；和
[0027]vi)通过在无水凝胶的3D细胞培养板中培养分离的诱导性多能干细胞来形成脑类器官，
[0028]其中，3D细胞培养板包括：
[0029]孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔(sub well)，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，并且
[0030]用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10
°
至60
°
的倾斜角(θ)。
[0031]体细胞可以是成纤维细胞，但不限于此，可以使用本领域已知的任何体细胞。
[0032]体细胞可以在一般的2D孔板、3D细胞培养板或根据本专利技术的3D板中培养。
[0033]脑类器官的形成可以包括，
[0034]在将诱导性多能干细胞制备成拟胚体后，
[0035]通过向聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产脑类器官的方法，所述方法包括：i)培养体细胞；ii)制备用于生产诱导性多能干细胞的无水凝胶的3D细胞培养板；iii)通过在所述无水凝胶的3D细胞培养板中将培养的体细胞重编程为诱导性多能干细胞来生产诱导性多能干细胞；iv)从步骤iii)的3D细胞培养板中分离所述诱导性多能干细胞；v)制备未涂覆水凝胶的3D细胞培养板，用于形成脑类器官；和vi)通过在无水凝胶的3D细胞培养板中培养分离的诱导性多能干细胞来形成脑类器官，其中，所述3D细胞培养板包括：孔板，所述孔板包括多个主孔和多个子孔，所述多个子孔形成在主孔的下部以注入细胞培养液并且包括在其底表面上的凹入部；和支持所述孔板的用于大容量和高速高内涵筛选(HCS)的连接件，并且用于高内涵筛选(HCS)的连接件包括配备有固定装置以与所述孔板的下端连接并且从所述孔板的下端分离的底座以及位于所述孔板的上部以连接到所述底座的盖，所述主孔具有形成为在预定位置逐渐变细的台阶，所述台阶相对于主孔的壁具有10
°
至60
°
的倾斜角(θ)。2.权利要求1所述的方法，其中，所述脑类器官的形成包括：在将诱导性多能干细胞制备成拟胚体后，通过向聚集的诱导性多能干细胞中添加神经上皮诱导培养基来诱导神经上皮细胞；通过向其中添加神经外胚层分化培养基来使神经上皮细胞分化成神经外胚层组织；通过向神经外胚层组织添加神经上皮芽诱导培养基来增殖神经上皮芽；和通过向增殖的神...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑锡，梁智勋，罗奎唤，丁庸勋，
申请(专利权)人：株式会社下一代生物，
类型：发明
国别省市：