一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体制造技术

本发明专利技术提供了一种能够成功在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的载体，含有顺序连接的如下片段：营养基因A、CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因；其中，CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因反向连接。本发明专利技术还提供了上述载体与氧化酶基因A构成的重组载体，含有该重组载体的马克斯克鲁维酵母重组菌可以稳定、高效地生产具有氧化功能的蛋白酶，具有工业化推广应用的价值。具有工业化推广应用的价值。具有工业化推广应用的价值。

【技术实现步骤摘要】
一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。

技术介绍

[0002]随着基因工程技术、分子生物学技术的不断发展，目前，已出现了多种用于表达外源基因的蛋白表达系统，目前常用的包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。原核表达技术以大肠杆菌表达系统为代表，具备遗传背景清楚、成本低、表达量高、产物分离纯化简单等优势，目前已十分成熟。因此，利用真核表达系统来表达蛋白越来越受到研究人员的重视。
[0003]昆虫、哺乳动物细胞表达系统的基因产物真实性好，但操作困难、产率低、成本高，不适于大规模生产；因此，以酵母表达系统为主的真核表达系统逐渐成为基础研究和工业生产的重要工具。
[0004]目前，常用的酵母表达系统以瞬时表达系统——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和稳定表达系统——毕赤酵母(Pichia pastoris)为典型代表。酿酒酵母生长密度低，不易于大规模发酵，分泌30kDa以上分子量的能力弱，生长周期长。毕赤酵母需要利用甲醇进行诱导表达，发酵过程存在危险因素，生长周期长。因此，发展生长周期短、蛋白表达量高和安全性高的酵母表达系统具有潜在工业价值。
[0005]马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)属于酵母科克鲁维属，是一种食品安全级酵母，具有生长快、耐高温等多种生理生化特点，目前利用基因工程技术，已经实现了数种外源蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达，例如α
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半乳糖苷酶、乳糖脱氢酶、耐热纤维素酶等(郭超,陈勇毅,周峻岗,等.一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的无痕基因组改造方法[J].复旦学报(自然科学版),2016,55(5):576
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586.)，在外源蛋白的表达中表现出很好的潜力。
[0006]氧化酶对化工、医药重要化合物的绿色合成具有重要意义，目前，尚未有报道表明马克斯克鲁维酵母能表达出具有活性的氧化酶。因此，开发基于马克斯克鲁维酵母系统，用于表达有活性的氧化酶具有潜在的价值。
[0007]对于马克斯克鲁维酵母这种新型的表达系统而言，目前对其生理特性、遗传特性的研究程度还有限，能够用于外源基因表达的重组载体的报道也较少；且现有报道的在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体均设计类型和种类均有限，例如专利申请CN105063082A、CN105063081A、CN105132452A、CN105063080A等公开的重组载体，均基于pKD1片段设计。
[0008]因此，研发新型的，能够在马克斯克鲁维酵母菌株中高效表达氧化酶的重组载体，值得进一步探索。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种在马克斯克鲁维酵母菌株中表达外源基因的重组载体。
[0010]本专利技术提供了一种载体，含有顺序连接的如下片段：营养基因A、CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因；
[0011]所述NC1启动子的序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]所述CYC终止子的序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]所述营养基因A的序列如SEQ ID NO.5所示；
[0014]所述复制子的序列如SEQ ID NO.7所示；
[0015]其中，CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因反向连接。
[0016]进一步地，上述抗性基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因，优选为氨苄霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.6所示。
[0017]进一步地，上述营养基因A和CYC终止子之间连接有SEQ ID NO.8所示序列；
[0018]和/或所述CYC终止子和NC1启动子之间连接有SEQ ID NO.9所示序列；
[0019]和/或所述NC1启动子和复制子之间连接有SEQ ID NO.10所示序列；
[0020]和/或所述复制子和抗性基因之间连接有SEQ ID NO.11所示序列；
[0021]和/或所述抗性基因和营养基因A之间连接有SEQ ID NO.12所示序列；
[0022]优选地，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.13所示。
[0023]本专利技术还提供了上述的载体用在马克斯克鲁维酵母菌中表达外源基因的应用，优选地，所述外源基因是氧化酶基因A。
[0024]本专利技术还提供了一种重组载体，它是含有目标基因的上述的载体。
[0025]进一步地，上述目标基因是氧化酶基因A，所述重组载体含有顺序连接的如下片段：营养基因A、CYC终止子、氧化酶基因A、NC1启动子、复制子、抗性基因；所述氧化酶基因A的序列如SEQ ID NO.3所示，且所述氧化酶基因A反向连接。
[0026]进一步地，上述CYC终止子和氧化酶基因A之间连接有SEQ ID NO.9所示序列；
[0027]优选地，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0028]本专利技术还提供了上述的重组载体在制备重组马克斯克鲁维酵母菌中的应用；优选地，所述马克斯克鲁维酵母菌是URA3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母菌。
[0029]本专利技术还提供了一种重组菌，它是包含上述的重组载体的马克斯克鲁维酵母菌；优选地，所述马克斯克鲁维酵母菌是URA3营养缺陷型马克斯克鲁维酵母菌。
[0030]本专利技术还提供了上述的重组菌制备氧化酶A蛋白的用途。
[0031]本专利技术选择氧化酶A作为表达对象。
[0032]本专利技术术语解释说明：“反向连接”：本专利技术说明书中给出的各片段序列均是以5
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端的方向表示的。权利要求书中限定“反向连接”则意味着该片段插入载体中的方向与说明书所给出的片段序列方向相反，即在载体中表示为其反向互补序列。
[0033]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种能够成功在马克斯克鲁维酵母菌株中复制和表达外源基因的重组载体，能够稳定、高效地生产氧化酶A蛋白，具有工业化推广应用的价值。
[0034]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离
本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0035]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0036]图1为重组载体pSUS1NPC的图谱。
[0037]图2为重组载体pKUPS6NPC的图谱。
[0038]图3为蛋白标准品聚丙烯酰胺凝胶电泳结果示意图(左)和重组载体pSUS1NPC和重组载体pKUPS6NPC表达蛋白的聚丙烯酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种载体，其特征在于，含有顺序连接的如下片段：营养基因A、CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因；所述NC1启动子的序列如SEQ ID NO.2所示；所述CYC终止子的序列如SEQ ID NO.4所示；所述营养基因A的序列如SEQ ID NO.5所示；所述复制子的序列如SEQ ID NO.7所示；其中，CYC终止子、NC1启动子、复制子、抗性基因反向连接。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述抗性基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因，优选为氨苄霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.6所示。3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述营养基因A和CYC终止子之间连接有SEQ ID NO.8所示序列；和/或所述CYC终止子和NC1启动子之间连接有SEQ ID NO.9所示序列；和/或所述NC1启动子和复制子之间连接有SEQ ID NO.10所示序列；和/或所述复制子和抗性基因之间连接有SEQ ID NO.11所示序列；和/或所述抗性基因和营养基因A之间连接有SEQ ID NO.12所示序列；优选地，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.13...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾知军，王韬，王浈羽，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：