一种替换PgsA来源的γ-PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种替换PgsA来源的γ

【技术实现步骤摘要】
一种替换PgsA来源的
γ
‑
PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及合成生物学和发酵工程领域，具体是单独替换PgsBCA多蛋白复合体中PgsA的来源，促进γ
‑
PGA的合成，尤其是一种替换PgsA来源的γ
‑
PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
聚谷氨酸(γ
‑
PGA)是一种由L
‑
谷氨酸和D
‑
谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ
‑
PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。
[0003]目前，微生物发酵是生产商业γ
‑
PGA的主要方法，因为它具有原料廉价，环境污染少，天然产物纯度高等优点。主要的γ
‑
PGA生产菌株是芽孢杆菌属，根据生产过程中，是否需要额外添加谷氨酸作为前体，γ
‑
PGA生产菌株可以分为两种类型，即谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株。有学者先后选择E.coli和C.glutamicum为底盘细胞，通过异源表达γ
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PGA合成酶，在无需谷氨酸添加的条件下成功实现了γ
‑
PGA的合成，但其产量不高，如专利CN103146630A生产γ
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聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途，是以野生型C.glutamicumATCC13869为出发菌株，转入含有γ
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PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。
[0004]目前，有学者提出了一些提高异源表达γ
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PGA合成酶提高γ
‑
PGA产量的方法，如专利CN113234764A一种γ
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聚谷氨酸的异源表达方法提出，在C.glutamicum F343pZM1
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capBCA菌株发酵培养过程中外源添加不同浓度的D
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Glu，用于合成不同D/L单体比的γ
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聚谷氨酸；又如专利CN112175982A一种γ
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PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用提出，在串联表达聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA的基础上，利用基因表达调控元件分别单独调控单个基因的表达水平，构建单独调控聚合酶基因重组菌株。但这些方法的产量提升有限。
[0005]如何更为高效、简单得提高异源表达γ
‑
PGA合成酶方法中γ
‑
PGA产量的问题，成为本领域的重点研究方向，具有重要的市场价值和应用前景。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术提供一种替换PgsA来源的γ
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PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法，通过以高产L
‑
谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ
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聚谷氨酸合成酶基因簇pgsBCA，在此基础上单独替换pgsA的来源，得到新的γ
‑
PGA合成酶的基因簇，用于促进γ
‑
PGA的合成。
[0007]本专利技术的第一个目的是，提供一种γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA
′
，所述基因簇pgsBCA
′
中的合成酶基因pgsA
′
的序列为如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示的其中任意一种。
[0008]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述合成酶基因pgsA
′
来源于枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌其中任意一种。
[0009]γ
‑
PGA合成酶PgsBCA由pgsB、pgsC和pgsA基因编码，负责催化谷氨酸合成γ
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PGA。γ
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PGA的合成能力受γ
‑
PGA合成酶PgsBCA来源的影响。而在PgsBCA多酶复合体中PgsB和PgsC主要负责催化的作用，PgsA负责γ
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PGA链的延伸和转运。因此，可通过替换其他来源的合成酶促进γ
‑
PGA的合成。
[0010]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述合成酶基因pgsB、pgsC来源于地衣芽孢杆菌的γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA。
[0011]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌从ATCC购买，菌株号为ATCC9945a。
[0012]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌来源的pgsB、pgsC、pgsA的序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.3所示。
[0013]本专利技术的第二个目的是，提供一种重组质粒，根据上述的基因簇pgsBCA
′
构建。
[0014]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒为pZM1
‑
BCA
′
(BS)、pZM1
‑
BCA
′
(BM)、pZM1
‑
BCA
′
(BAM)，所述重组质粒中的BS、BM、BAM分别代表枯草芽孢杆菌来源、甲基营养型芽孢杆菌来源、解淀粉芽孢杆菌来源的pgsA
′
。
[0015]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，重组质粒采用同尾酶连接技术构建，所述同尾酶连接技术是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。
[0016]本专利技术的第三个目的是，提供一种聚合酶基因重组菌株，根据上述的重组质粒转化构建。
[0017]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，上述重组菌株以C.glutamicum F343为底盘。
[0018]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株包括BCA
′
(BS)、BCA
′
(BM)、BCA
′
(BAM)。
[0019]本专利技术的第四个目的是，提供一种合成聚谷氨酸的方法，利用上述的重组菌株发酵培养，用于生产聚谷氨酸，用于提高γ
‑
PGA的产量。
[0020]本专利技术的第五个目的是，提供一种替换PgsA来源提高聚谷氨酸产量的方法，以C.glutamicum F343为底盘，异源表达如上述的γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA
′
，将得到的重组菌株发酵培养。
[0021]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述的重组菌株发酵培养的步骤为：将所述重组菌株的种子液接种至发酵培养基，先于32...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA
′
，其特征在于，所述基因簇pgsBCA
′
中的合成酶基因pgsA
′
的序列为如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示的其中任意一种。2.根据权利要求1所述的γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA
′
，其特征在于，所述合成酶基因pgsA
′
来源于枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌其中任意一种。3.根据权利要求1所述的γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA
′
，其特征在于，所述合成酶基因pgsB、pgsC来源于地衣芽孢杆菌的γ
‑
PGA合成酶的基因簇pgsBCA。4.一种重组质粒，根据权利要求1
‑
3任一所述的基因簇pgsBCA
′
构建。5.一种聚合酶基因重组菌株，根据权利要求4所述的重组质粒转化构建。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，以C.glutamicum F343为底盘。7.一种合成聚谷氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的重组菌株发酵培养。8.一种替换PgsA来源提高聚谷氨酸产量的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国强，王籍阅，沈建成，刘婉婧，张晓娟，张晓梅，史劲松，许正宏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：