神经干细胞标志物的流式检测方法技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞标志物的流式检测方法，包括以下步骤：(1)样本洗涤；(2)受体阻断：加入Fc受体阻断剂，孵育；(3)细胞固定：向细胞悬液中加入Fixation Buffer固定剂，孵育；(4)细胞破膜：加入破膜液Perm BufferⅢ，孵育；(5)细胞染色：加入相应的抗体，孵育；所述抗体为Nestin抗体、Sox1抗体和Sox2抗体；(6)数据分析：进行流式检测，对Nestin+、Sox1+Sox2的表达进行分析。本发明专利技术的神经干细胞标志物的流式检测方法，受体阻断、固定、破膜条件等过程经过优化，重复性高，稳定性好，解决了在工艺研发过程中流式检测不稳定的问题。程中流式检测不稳定的问题。程中流式检测不稳定的问题。

【技术实现步骤摘要】
神经干细胞标志物的流式检测方法


[0001]本专利技术涉及一种神经干细胞标志物的流式检测方法，属于细胞生物学检测领域。

技术介绍

[0002]流式细胞技术(flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是当前最先进的细胞定量分析技术之一。目前，流式细胞技术主要应用于：(1)DNA倍体分析；(2)借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；(3)细胞分选和细胞收集；(4)医学应用；(5)应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。
[0003]虽然流式检测是一个公开的检测技术，但在行业内，受体阻断、固定、破膜等参数较随意，并没有形成标准化的方案，特别在细胞工艺研究过程中，稳定性及重复性较差，缺乏标准的流式检测方法。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种神经干细胞标志物的流式检测方法。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种神经干细胞标志物的流式检测方法，包括以下步骤：
[0007](1)样本洗涤：向待检测的神经干细胞样本中加入适量洗涤液，离心，并重复一次；
[0008](2)受体阻断：用PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度，加入Fc受体阻断剂，孵育；
[0009](3)细胞固定：向细胞悬液中加入Fixation Buffer固定剂，孵育；
[0010](4)细胞破膜：加入破膜液Perm BufferⅢ，孵育；
[0011](5)细胞染色：加入相应的抗体，孵育；所述抗体为Nestin抗体、Sox1抗体和Sox2抗体；
[0012](6)数据分析：进行流式检测，对Nestin+、Sox1+Sox2的表达进行分析。
[0013]进一步地，所述步骤(1)中，洗涤液，是向PBS缓冲液中加入1％(体积百分数)的FBS(胎牛血清)配制而成的。
[0014]进一步地，所述步骤(1)中，离心条件为：4℃，500g离心5min，升9降9。
[0015]进一步地，所述步骤(2)中，调整细胞密度至1*106/100μL。
[0016]进一步地，所述步骤(2)中，Fc受体阻断剂的用量为：每100μL细胞悬液中含有5～10μL Fc。
[0017]进一步地，所述步骤(3)中，Fixation Buffer固定剂的用量为：每150μL细胞悬液中加入250μLFixation Buffer固定剂。
[0018]进一步地，所述步骤(4)中，破膜液的用量为：每150μL细胞悬液中加入1mL破膜液。
[0019]进一步地，所述步骤(5)中，加入Nestin抗体的浓度为0.2mg/mL，Sox2抗体的浓度
为0.2mg/mL，Sox1的浓度为0.125mg/mL。
[0020]进一步地，所述步骤(2)中，孵育的具体条件为室温孵育5～10min；所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育的具体条件均为4℃孵育30～40min。
[0021]进一步地，所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育后，加入适量洗涤液，进行离心洗涤。
[0022]本专利技术的神经干细胞标志物的流式检测方法，是借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的检测技术，其中受体阻断、固定、破膜条件等过程经过优化，重复性高，稳定性好，大大解决了在工艺研发过程中流式检测不稳定的问题。本专利技术提供的标准的神经干细胞标志物的流式检测方法，为神经干药物的工艺开发提供了依据，同时，也可以为其他类型的细胞提供技术支持。
附图说明
[0023]图1：破膜时间优化结果示意图。
[0024]图2：抗体浓度滴定优化结果示意图。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0026]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
[0027]本专利技术所用洗涤液，是向PBS缓冲液中加入1％(体积百分数)的FBS(胎牛血清)配制而成的，有效期1天。
[0028]实施例1神经干细胞标志物的流式检测
[0029]神经干细胞为人源悬浮培养的细胞球，检测指标为：Nesin、Sox1+Sox2。具体操作如下：
[0030](1)样本洗涤：取6
×
106消化后的神经干细胞单细胞悬液(消化采用常规方法)，加入1mL洗涤液，4℃，500g离心5min，升9降9，弃上清；重复洗涤一次。
[0031](2)受体阻断：用PBS缓冲液调整细胞浓度至1*106/100μL，根据细胞悬液的体积加入Fc受体阻断剂，确保每100μL细胞悬液中含有5μL Fc，常温孵育10min，并分装细胞至4个流式管中。
[0032](3)细胞固定：每个流式管加入250μL Fixation Buffer固定剂，混匀后，4℃孵育30min；固定完成后，每个流式管加入1mL洗涤液，混匀，4℃，600g离心5min，升9降9，弃上清。
[0033](4)细胞破膜：每个流式管加入1mL提前预冷的Perm BufferⅢ，混匀，4℃孵育30min(对破膜时间进行了优化，如图1所示，可见，破膜时间为30min时，效果最佳)；破膜完成后，每个流式管加入1mL洗涤液，混匀，4℃，700g离心5min，升9降9，弃上清，并重复1次。
[0034](5)染色：每个流式管加入100μL PBS缓冲液，加入相应的Nestin、Sox1、Sox2抗体(经过抗体浓度滴定优化，结果如图2所示，确定的最佳浓度为：Nestin的浓度为0.2mg/mL，Sox2的浓度为0.2mg/mL，Sox1的浓度为0.125mg/mL)，4℃避光孵育30min；孵育后，每个流式
管加入1mL洗涤液，混匀，4℃，700g离心5min，升9降9，弃上清。
[0035](6)流式检测、数据处理：画门圈出目的细胞群并调节合适电压，样本同型抗体为对照，统计样本的阳性率，并形成峰图作为最终实验结果。
[0036]不同人员进行多次重复检测，结果如表1、表2所示。
[0037]结论：由图1的数据可得到最佳的破膜参数，图2可获得最佳的抗体浓度，保证数据的准确性。表1和表2证明了本专利技术的方法的稳定性和重复性。
[0038]表1
[0039][0040][0041]表2
[0042]分析人员NestinSox2Sox1人员197.93本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样本洗涤：向待检测的神经干细胞样本中加入适量洗涤液，离心，并重复一次；(2)受体阻断：用PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度，加入Fc受体阻断剂，孵育；(3)细胞固定：向细胞悬液中加入Fixation Buffer固定剂，孵育；(4)细胞破膜：加入破膜液Perm BufferⅢ，孵育；(5)细胞染色：加入相应的抗体，孵育；所述抗体为Nestin抗体、Sox1抗体和Sox2抗体；(6)数据分析：进行流式检测，对Nestin+、Sox1+Sox2的表达进行分析。2.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，洗涤液是向PBS缓冲液中加入1％的FBS配制而成的。3.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：进一步地，所述步骤(1)中，离心条件为：4℃，500g离心5min，升9降9。4.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，调整细胞密度至1*106/100μL。5.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨敏，陈小威，刘使君，刘昌明，朱紫薇，宁文洁，张换红，郭红玉，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：