快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法技术

本申请公开一种快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法，包括以下步骤：获取血小板的氨基酸转运蛋白的特异性抗体；将所述特异性抗体加入血小板悬液中形成待检测的样品；通过流式细胞术检测所述样品的特异性信号；统计分析所述特异性信号确认样品的应激状况。本申请的方法利用了流式细胞术的优势，可以针对单个血小板进行分析，从而可以从统计的角度分析血样所对应个体的血小板的整体应激情况，为后续判别和预测病患的病情提供参考数据。判别和预测病患的病情提供参考数据。判别和预测病患的病情提供参考数据。

【技术实现步骤摘要】
快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法


[0001]本申请涉及医学检验
，尤其涉及一种快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法。

技术介绍

[0002]血小板是无核的膜性结构细胞，属于非传统意义细胞，易受到细胞外微环境刺激而发生不同程度的骨架重组，血小板细胞表型改变能一定程度上反应人体的应激状态。血小板的EAAT2(Excitatory Amino Acid Transporter2，兴奋性氨基酸转运体2)主导血小板的谷氨酸摄入，主要分布在血小板膜和血小板的α颗粒膜上。当血小板实时状态发生改变时，EAAT2膜蛋白的分布将随血小板的骨架重组而显著改变。现有技术常用免疫电镜技术(Immunoelectron microscopy，IEM)和免疫荧光技术(Immunofluorescence，IF)对EAAT2膜蛋白进行检测，但这两个技术对血样的处理过程非常繁琐，不仅检测周期长，实验方案也欠灵活，且过于繁琐或过多干预的操作都可能对EAAT2膜蛋白的检测结果产生极大影响，检测结果不够准确，也不适宜在临床实验室推广。

技术实现思路

[0003]本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种时效性高、操作简便的快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法。
[0004]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0005]一种快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法，包括以下步骤：
[0006]获取血小板的氨基酸转运蛋白的特异性抗体；
[0007]将所述特异性抗体加入血小板悬液中形成待检测的样品；
[0008]通过流式细胞术检测所述样品的特异性信号；
[0009]统计分析所述特异性信号确认样品的应激状况。
[0010]具体地，所述氨基酸转运蛋白为膜蛋白。
[0011]可选择地，所述特异性抗体包括能与所述氨基酸转运蛋白的胞外片段进行免疫性结合的第一抗体，以及能与所述第一抗体进行免疫性结合的显色标记物。
[0012]进一步可选择地，所述特异性抗体还包括能与泛血小板标志物CD61进行免疫性结合的第三抗体。
[0013]优选地，所述氨基酸转运蛋白特指兴奋性氨基酸转运体2。
[0014]进一步地，所述血小板悬液的制备方法为：
[0015]将新鲜采集的血液用枸橼酸钠抗凝；
[0016]以200g的离心力室温离心10min；
[0017]收获血浆即得富血小板血浆(PRP)；
[0018]用含HEPES的台氏液以1:20稀释所述富血小板血浆，即得血小板悬液。
[0019]可选择地，所述将所述特异性抗体加入血小板悬液之前，根据统计分析的需要加
入应激调节剂。
[0020]进一步可选择地，所述应激调节剂包括针对所述血小板的激活剂、抑制剂、干扰剂或抗干扰剂。
[0021]具体地，所述应激调节剂包括作为激活剂的凝血酶，作为抑制剂的兴奋性氨基酸转运体抑制剂，以及用于阻止纤维蛋白聚合从而阻止血凝块形成的抑制剂。
[0022]更进一步地，所述将所述特异性抗体加入血小板悬液之后，使用1％多聚甲醛固定细胞30min，制得待检测样品。
[0023]进一步地，所述特异性信号关联兴奋性氨基酸转运蛋白与血小板的关系，统计流式细胞仪的细胞分析结果，确认血小板的对应不同应激状况下的细胞表型。
[0024]与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
[0025](1)本申请的方法利用了流式细胞术的优势，可以针对单个血小板进行分析，从而可以从统计的角度分析血样所对应个体的血小板的整体应激情况，为后续判别和预测病患的病情提供参考数据；
[0026](2)本申请的方法利用了血小板与EAAT2膜蛋白作用的关联，提供了一种可以实时检测卒中、神经退行性疾病等的血液检测方法，提高了临床推广的可能性；
[0027](3)本申请的方法的样品准备过程简单，对血小板的干扰降到了尽可能低，尽可能保持了细胞应激时的状态，有利于反映更真实的检测结果，也提高了检测效率，有利于在临床检测中应用；
[0028](4)本申请的方法所制备的样品，可以通过添加应激调节剂模拟应激或者药物干预的场景，为后续判别和预测病患的病情提供了更丰富的参考数据，有利于提高判断和预测的准确性。
附图说明
[0029]图1为利用本申请快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法所统计的血小板EAAT2膜蛋白的表达模式示意图，主要显示凝血酶激活前后及抑制后再激活条件下血小板EAAT2膜蛋白的表达变化。
[0030]图2为利用本申请快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法所统计的四种不同血小板亚群，主要显示样品中的血小板在四个区域内的分布情况。
[0031]图3为利用本申请快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法对具体样品进行检测的结果，主要示出不同血样所反映的细胞应激情况。
具体实施方式
[0032]以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
[0033]本申请提供了一种快速检测血小板对血浆谷氨酸的应激状况的方法，包括以下步骤：
[0034]获取血小板的氨基酸转运蛋白的特异性抗体；
[0035]将所述特异性抗体加入血小板悬液中形成待检测的样品；
[0036]通过流式细胞术检测所述样品的特异性信号；
[0037]统计分析所述特异性信号确认样品的应激状况。
[0038]具体地，所述兴奋性氨基酸转运蛋白所引导的谷氨酸跨质膜运输在生理学中起着核心作用，细胞内和细胞外谷氨酸浓度的失调与病理状况有关，而细胞内和细胞外谷氨酸浓度的差值与细胞膜上的兴奋性氨基酸转运蛋白的状态有关，细胞内和细胞外谷氨酸的浓度差也影响兴奋性氨基酸转运蛋白的分布和状态。对于血小板，血小板容易因为血液中的刺激物导致细胞骨架重组，而细胞的骨架重组一定程度伴随着细胞膜上兴奋性氨基酸转运蛋白的分布和表达量的改变，具体可能引发胞浆内的兴奋性氨基酸转运蛋白被募集到细胞膜表面或使已定位于细胞膜上的转运蛋白结构性翻转至正确的功能位，从而使能正常发挥转运功能的膜蛋白数量产生变化。
[0039]血小板上的兴奋性氨基酸转运蛋白EAAT2(Excitatory Amino Acid Transporter 2，兴奋性氨基酸转运体2)是目前发现的血小板摄入兴奋性氨基酸(主要是谷氨酸)最重要的EAAT亚型。谷氨酸是哺乳动物神经系统中最关键的一种兴奋性氨基酸类神经递质，但过量的谷氨酸会导致神经的兴奋性毒性损伤。脑内胞外谷氨酸只能依赖兴奋性氨基酸转运蛋白进行回收利用，在血液循环中，血小板EAAT2对血浆的谷氨酸稳态具有非常重要的调控作用。因此，检测血小板EAAT2膜蛋白的表达能够一定程度上反映血小板在血浆微环境中对谷氨酸浓度波动的感应，或者说从血小板摄取谷氨酸的状态能够一定程度上反映人体当前对血浆谷氨酸刺激的应激状态。
[0040]一种可能的实施方式是，选用可特异识别EAAT2胞外段结构的特异性抗体，即俗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测血小板对谷氨酸的应激状况的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取血小板的氨基酸转运蛋白的特异性抗体；将所述特异性抗体加入血小板悬液中形成待检测的样品；通过流式细胞术检测所述样品的特异性信号；统计分析所述特异性信号确认样品的应激状况。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸转运蛋白为膜蛋白。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述特异性抗体包括能与所述氨基酸转运蛋白的胞外段结构进行免疫性结合的第一抗体，以及能与所述第一抗体进行免疫性结合的显色标记物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述特异性抗体还包括能与泛血小板标志物CD61进行免疫性结合的第三抗体。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氨基酸转运蛋白为兴奋性氨基酸转运体2。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血小板悬液的制备方法为：将新鲜采集的血液用枸橼酸钠抗凝；以200g的离心力室温离心1...

【专利技术属性】
技术研发人员：何穗芬，周宏伟，潘沅，高毅，陈学东，余楠，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：