一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及植物遗传工程技术领域，提出了一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用，命名为GhCYSTM6A，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。GhCYSTM6A基因在拟南芥中过表达，转基因拟南芥对黄萎病抗性显著提高。在抗病棉花品种冀棉2016中沉默GhCYSTM6A，显著降低了棉花植株对黄萎病的抵抗能力。因此，GhCYSTM6A基因有利于提高植物的黄萎病抗性，为培育抗黄萎病植物品种提供了理论依据。论依据。论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及植物遗传工程
，具体的，涉及一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]棉花黄萎病属于典型的土传维管束系统性病害，是我国棉花生产上危害最为严重的病害，影响着我国棉花生产的可持续发展。棉花黄萎病田间防治难度大，培育抗病品种是最为经济有效的措施。虽然经过科研人员的努力曾培育出一些抗病棉花品种，但由于黄萎病菌变异快，育成的抗病品种推广种植几年后抗病性逐渐丧失。加之陆地棉中缺乏高抗黄萎病种质资源、传统育种周期长、效率低，使得我国棉花抗黄萎病育种进展缓慢。
[0003]转基因技术作为棉花遗传改良快速有效的方法，为棉花遗传育种带来了巨大的发展空间。深入挖掘、研究棉花黄萎病抗病基因，认识棉花抗黄萎病分子机理，可以为利用生物育种方法提高棉花黄萎病抗性提供理论依据和目标基因。
[0004]小分子多肽广泛存在于真核生物体内，参与植物生长发育及防御和胁迫响应的各个方面。根据是否分泌分为两类：分泌型多肽、非分泌型多肽。CYSTM(The Cysteine
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rich Transmembrane Module，富含半胱氨酸的跨膜模块)是一种小分子蛋白质家族，属于一种新的非分泌型富半胱氨酸肽，大多数成员的功能及作用机制仍不清楚。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用，有助于解决棉花黄萎病田间防治难度大、棉花抗黄萎病育种进展缓慢的问题。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽的编码基因，核苷酸序列为如1)或2)：
[0008]1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0009]2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
[0010]一种富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽，由所述的基因编码得到，具有如1)或2)所示的氨基酸序列：
[0011]1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，
[0012]2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
[0013]一种所述的富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽的编码基因在防治植物黄萎病中的应用。
[0014]一种所述富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽在防治植物黄萎病中的应用。
[0015]作为进一步的技术方案，在植物体内基因过表达，提高植物黄萎病抗性。
[0016]本专利技术的有益效果为：
[0017]1、本专利技术中首次从陆地棉品种冀棉2016叶片cDNA中克隆到一个编码富含半胱氨酸的非分泌型的小分子肽基因，通过与陆地棉参考基因组和拟南芥中同源序列的比对，将该基因命名为GhCYSTM6A，本专利技术发现该基因的表达与黄萎病的侵染密切相关，为培育抗黄萎病植物品种提供了理论依据。
[0018]2、将GhCYSTM6A基因在拟南芥中过表达，转基因拟南芥对黄萎病抗性显著提高。在抗病棉花品种冀棉2016中沉默GhCYSTM6A，显著降低了棉花植株对黄萎病的抵抗能力。
[0019]3、GhCYSTM6A基因及其编码蛋白可应用于防治棉花黄萎病，提高植物的黄萎病抗性，可用于棉花及其他植物的抗黄萎病遗传改良或分子育种方面，对于植物黄萎病抗性遗传改良具有重要意义。
附图说明
[0020]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0021]图1为实施例1中GhCYSTM6A与不同蛋白的进化树分析；
[0022]图2为实施例1中GhCYSTM6A亚细胞定位图；
[0023]图3为实施例2中35S启动子驱动GhCYSTM6A在转基因拟南芥中的超表达情况图；
[0024]图4为实施例2中大丽轮枝菌侵染拟南芥的黄萎病抗性鉴定图；
[0025]图5为实施例3大丽轮枝菌侵染VIGS沉默棉花植株的黄萎病抗性鉴定图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1：GhCYSTM6A基因的克隆、测序、进化分析和亚细胞定位
[0028](1)植物材料
[0029]冀棉2016
[0030](2)实验方法
[0031]采用Trizol法提取冀棉2016叶片RNA，参照cDNA合成反转录试剂盒PrimeScript
TM
RT reagent Kit(TaKaRa)说明书将RNA反转录成cDNA。
[0032](3)序列分析
[0033]在冀棉2016叶片的cDNA中克隆得到GhCYSTM6A基因的CDS序列，序列全长237bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0034]ATGAATCACAACCAGCAACACTTCAATCAATCATCAGCAGCTGCATACCCACCACCACCACCCTCCACGGCGCCAGGACCCTACGTGACTGCACCGCCGGCCGGTTACCCGATGACCAAAGACGAGTACAGTCAGCAAAATCCGGCTGCTGTCGAAACCAAGTCCAGAGGTGATGGATTCTGGAAAGGATGTTGTGCTGCCCTTTGCTGTTGTTGCCTTCTGGATGCATGCTTTTGA
[0035]编码蛋白质包含78个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
[0036]MNHNQQHFNQSSAAAYPPPPPSTAPGPYVTAPPAGYPMTKDEYSQQNPAAVETKSRGDGFWKGCCAALC
CCCLLDACF
[0037]将氨基酸序列在SMART和Pfam蛋白数据库进行分析，发现GhCYSTM6A蛋白包含CYTSTM domain(PF12734)，属于CYSTM家族成员。利用本地化blast
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2.12.0软件比对陆地棉基因组，发现GhCYSTM6A基因位于A07染色体上。NCBI在线进行blastp比对发现，该GhCYSTM6A蛋白与XP_016703581.1的同源性最高。XP_016703581.1也来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)，蛋白功能未见注释，同时目前还未见其他物种中报道其同源基因的功能。
[0038](4)GhCYSTM6A进化分析
[0039]取NCBI在线blastp比对结果中同源性大于75％且Evalue值小于1e
‑5的所有蛋白序列构建进化树，这些蛋白被分成3个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽的编码基因，其特征在于，核苷酸序列为如1)或2)：1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。2.一种富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽，其特征在于，由权利要求1所述的基因编码得到，具有如1)或2)所示的氨基酸序列：1)如SEQ ID NO.2所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡肖，张建宏，王海涛，唐丽媛，李兴河，张素君，刘存敬，
申请(专利权)人：河北省农林科学院棉花研究所河北省农林科学院特种经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：