一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA及其应用。本发明专利技术以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbWD40的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbWD40基因的上游调控因子IbPPA。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbWD40启动子与上游调控因子IbPPA之间存在相互作用。本发明专利技术在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。新的思路和线索。新的思路和线索。

【技术实现步骤摘要】
Polymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbWD40的启动子DNA片段，并将启动子IbWD40构建到pAbAi载体中，扩增IbWD40的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
[0009]PIbWD40
‑
F：5'
‑
TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA
‑
3'和
[0010]PIbWD40
‑
R：5'
‑
TCTCATACCACCACACCCTAGTGG
‑
3'。
[0011]构建的pAbAi
‑
PIbWD40诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
[0012]本专利技术其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi
‑
PIbWD40诱感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbWD40基因表达的上游调控因子为IbPPA。
[0013]因此，本专利技术的第一个目的是提供一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的表达盒。
[0017]本专利技术的第五个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
[0018]IbPPA
‑
F：5'
‑
ATGGTTCCACCTATTGAAACACCA
‑
3'和
[0019]IbPPA
‑
R：5'
‑
CTATCGCCTCAGGCTTTCCA
‑
3'。
[0020]本专利技术的第六个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA在促进甘薯IbWD40转录因子表达中的应用。
[0021]本专利技术的第七个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA在促进甘薯花色素苷生物合成中的应用。
[0022]本专利技术的第八个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA在甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
[0023]本专利技术的第九个目的是提供一种促进甘薯花色素苷合成的方法，是在甘薯植株中过表达上述的调控因子IbPPA。
[0024]进一步的，为了进一步验证筛选出来的调控因子IbPPA与启动子IbWD40结合，将IbPPA构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7
‑
IbPPA酵母重组表达载体质粒与pAbAi
‑
PIbWD40诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD
‑
53转化的菌株在SD/
‑
Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照PIbWD40
‑1‑
pAbAi+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/
‑
Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而PIbWD40
‑1‑
pAbAi+IbPPA
‑
pGADT7在SD/
‑
Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbPPA蛋白能结合在启动子IbWD40上。
[0025]进一步的，为了验证启动子IbWD40与其调控因子IbPPA的相互作用，本专利技术将IbPPA构建到过表达载体pGreenII 0029 62
‑
SK上，将PIbWD40插入到载体pGreenII 0800
‑
LUC荧光素酶的前端作为报告质粒，选择pGreenII 0029 62
‑
SK载体中Sac I和Xho I及
pGreenII0800
‑
LUC载体中的Kpn I和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2。将测序成功的重组菌液提取质粒后与PIbWD40+pGreenII 0800 LUC重组质粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示IbPPA能够提高IbWD40启动子的活性(图2)，说明IbPPA能够促进IbWD40的表达。
[0026]进一步的，为了明确上游调控因子IbPPA的功能，本专利技术构建了IbPPA与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbPPA的作用场所进行定位。通过构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，pCambia1300
‑
GFP作为阳性对照。空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbPPA蛋白在细胞核中表达(图3)，表明IbPPA是一个典型的转录因子。
[0027]本专利技术的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子IbWD40的上游调控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子IbPPA。此专利技术结果在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
附图说明
[0028]图1为IbWD40启动子与其上游调控因子IbPPA回转验证结果。阳性对照为p53AbAi+AD
‑
53，阴性对照为PIbWD40
‑1‑
pAbAi+AD，阳性菌落(PIbWD40
‑1‑
pAbAi+IbPPA
‑
AD)说明相应上游调控因子蛋白(IbPPA)能结合在IbWD40启动子上，AD：pGADT7。
[0029]图2为IbWD40启动子与其上游调控因子IbPPA的相互作用。
[0030]图3为IbWD40启动子上游调控因子IbPPA在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
[0032]实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库
[0033](1)用Trizol法从紫心甘薯(品系A5)块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA。
[0034](2)扩增得到的c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA的基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。5.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒。6.一种权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbPPA
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F：5'
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ATGGTTCCACCTATTGAAACACCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：付丹文，杨少华，黄咏虹，黄俊坚，
申请(专利权)人：广东省科学院南繁种业研究所，
类型：发明
国别省市：