从经修饰以表达因子VIII的慢病毒载体的制剂中去除游离因子VIII的方法技术

本文提供了从宿主细胞纯化病毒载体的病毒载体产生过程和方法。毒载体产生过程和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从经修饰以表达因子VIII的慢病毒载体的制剂中去除游离因子VIII的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月24日提交的美国临时申请号63/043/697和2020年8月6日提交的美国临时申请号63/062,120的优先权。上述临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

技术介绍

[0003]慢病毒载体(LV)和其他病毒载体是用于基因疗法的有吸引力的工具(Thomas等人，2003)。LV可以转导众多种组织，包括非分裂细胞，如肝细胞、神经元和造血干细胞。此外，LV可以整合到靶细胞基因组中并提供长期的转基因表达。
[0004]鉴于对用于基因疗法的病毒载体的需求不断增加，改进的纯化方法将是迫切需要的。在此，我们公开了用于产生适于全身施用至受试者的病毒载体组合物的改进方法。

技术实现思路

[0005]本公开文本涉及用于基因疗法应用的包膜病毒载体的纯化。本公开文本至少部分地基于以下发现，即在常规纯化过程期间，不希望的转基因蛋白污染物可以与病毒载体共纯化。在某些实施方案中，转基因蛋白污染物是在生物产生过程期间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从宿主细胞纯化病毒载体的方法，所述方法包括：(i)使包含所述病毒载体和转基因蛋白污染物的组合物与能够选择性结合所述转基因蛋白污染物的第一色谱基质接触；以及(ii)在所述色谱基质的流出物中回收所述病毒载体，从而分离所述病毒载体与所述转基因蛋白污染物。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括(iii)使包含所述病毒载体和所述转基因蛋白污染物的所述组合物与能够选择性结合所述病毒载体的第二色谱基质接触，以及(iv)从所述第二色谱基质洗脱所述病毒载体，其中步骤(iii)和(iv)在步骤(i)之前进行。3.根据权利要求1所述的方法，其还包括(iii)使从步骤(ii)回收的病毒载体与能够选择性结合所述病毒载体的第二色谱基质接触，以及(iv)从所述第二色谱基质洗脱所述病毒载体。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)重复多次。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)在稳定所述转基因蛋白污染物的药剂的存在下进行。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述药剂是CaCl2。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括步骤(v)将包含所述病毒载体和所述转基因蛋白污染物的所述组合物的盐的浓度调整至目标盐浓度。8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(v)在步骤(i)之前进行。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中如果步骤(iii)和(iv)在步骤(i)之前进行，则步骤(v)在步骤(iv)与(i)之间进行。10.根据权利要求7
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9中任一项所述的方法，其中所述盐是NaCl。11.根据权利要求7
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10中任一项所述的方法，其中所述目标盐浓度为约0.2M至约0.6M。12.根据权利要求7
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11中任一项所述的方法，其中所述目标盐浓度为约0.4M。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述目标盐浓度为约200mM NaCl至约600mM NaCl。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)是通过用加载缓冲液中的包含所述病毒载体和所述转基因蛋白污染物的所述组合物加载所述第一色谱基质来进行，所述加载缓冲液包含pH约7.0至约7.5的Tris
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HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，步骤(iv)是通过用洗脱缓冲液从所述第二色谱基质洗脱所述病毒载体来进行，所述洗脱缓冲液包含pH约7.0至约7.5的Tris
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HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括步骤(vi)将与所述转基因蛋白污染物分离的所述病毒载体与一种或多种药物赋形剂组合以产生包含所述病毒载体的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含所述转基因蛋白污染物。17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(vi)是通过用配制缓冲液对与所述转基因蛋白污染物分离的所述病毒载体进行超滤/渗滤(UF/DF)来进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述UF/DF步骤包括切向流过滤(TFF)。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述配制缓冲液是包含NaCl和蔗糖的磷酸盐或组氨酸缓冲液。20.根据权利要求16
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19中任一项所述的方法，其中所述药物组合物含有参考病毒载体组合物中存在的所述转基因蛋白污染物的小于20％，所述参考病毒载体组合物用所述第二色谱基质纯化但没有用所述第一色谱基质纯化。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是包膜病毒载体。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述包膜病毒载体是慢病毒载体。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体编码所述转基因蛋白污染物。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因蛋白污染物是通过由转移质粒表达而在所述宿主细胞中产生的。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一色谱基质选自亲和色谱柱、阳离子交换(CEX)色谱柱、多元色谱(MMC)柱和疏水相互作用色谱(HIC)柱。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一色谱基质是亲和色谱柱，所述亲和色谱柱包含与所述转基因蛋白污染物特异性结合的亲和配体。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二色谱基质是阴离子交换(AEX)色谱基质。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二色谱基质是阴离子交换(AEX)膜。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因蛋白是凝血因子。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述凝血因子是FVIII或FVIIIXTEN。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述亲和色谱基质是VIIISelect。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述病毒载体和所述转基因蛋白污染物的所述组合物是通过以下方式产生的细胞培养上清液：培养所述宿主细胞，并且从所述宿主细胞分离和澄清所述细胞培养上清液。35.根据权利要求34所述的方法，其中对所述细胞培养上清液进行核酸酶处理。36.一种从宿主细胞纯化慢病毒载体(LVV)的方法，所述慢病毒载体包含FVIII转基因，所述方法包括：(i)使包含所述慢病毒载体和FVIII转基因蛋白污染物的组合物与能够选择性结合FVIII转基因蛋白污染物的第一色谱基质接触；以及(ii)在所述色谱基质的流出物中回收所述慢病毒载体，从而分离所述慢病毒载体与所述FVIII蛋白污染物。37.根据权利要求36所述的方法，其还包括(iii)使包含所述慢病毒载体和所述FVIII转基因蛋白污染物的所述组合物与能够选
择性结合所述慢病毒载体的第二色谱基质接触，以及(iv)从所述第二色谱基质洗脱所述慢病毒载体，其中步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：泰莱托恩基金会圣拉斐尔医院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：