一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术利用甲苯噻嗪

【技术实现步骤摘要】
一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，涉及一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]甲苯噻嗪(xylazine,C12H16N2S)又名甲苄噻嗪、赛拉嗪，是一种广泛使用的兽用镇静止痛剂，有麻醉作用，该化合物通过作用于α2受体和外周神经，起到局部麻醉和肌肉松弛作用。甲苯噻嗪是α2
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肾上腺素受体激动剂，全身应用后能产生一定的麻醉作用，麻醉诱导时间短，有良好的镇静和肌松作用，但仅有微弱的镇痛作用，且对呼吸及心脏传导系统有抑制作用，并刺激唾液腺及气管腺体的分泌增加。腹腔注射甲苯噻嗪后可以透过血脑屏障进入大脑，通过激活下丘脑的肽能神经元，使垂体中的脑啡肽和内啡肽的分泌和合成增加，两者进入血液循环调节血管和呼吸系统功能，引起血压下降、呼吸抑制等。
[0003]甲苯噻嗪对人的麻醉作用迅速，肌肉注射15
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20min、静脉注射1
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2min产生作用，药效可持续4小时以上。甲苯噻嗪在体内吸收、代谢、分解快，仅有约8％的原体从尿液排出，口服10
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15小时后几乎排泄完全。其在血液中原型物较少，且难以提取净化，易被漏检。因此建立血液中甲苯噻嗪的快速、简便准确的检验方法对相关案件的检验至关重要。
[0004]目前，常用的甲苯噻嗪的初筛方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、免疫层析技术等。确认方法主要用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱
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质谱法(GC/MS)等理化检测方法。上述方法均需要精密仪器和特定的试验条件，在实际应用中存在了较大的局限。为了解决现场大规模应用的问题，免疫学法由于其检测速度快，成本低，通量高，部分免疫学检测方法(胶体金纸层析法)还具有操作简单，不需要额外设备等优点，倍受重视。因此，开发出优良的甲苯噻嗪诊断用抗原抗体成为了决定免疫学法应用前景的关键。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种甲苯噻嗪抗体，可有效提高检测甲苯噻嗪的酶标产品和金标产品的检出率，降低假阳率。它能以最快的速度为相关检验检疫部门提供可靠实验室诊断，适用于戒毒所、医院、高危人群普查，特种行业和招工体检工作中筛查以及卫生防疫部门对甲苯噻嗪药物的滥用监管以及食品检查。
[0006]本专利技术提供一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体，所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列为SEQ ID NO:3～5；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列为SEQ ID NO:11～13。
[0007]进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
[0008]本专利技术还提供一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体，所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，编码所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列为SEQ ID NO:6～8；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3核苷酸序列为SEQ ID NO:14～16。
[0009]进一步地，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的
核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
[0010]进一步地，所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体为完整的抗体或者经处理后具有甲苯噻嗪结合活性的片段。
[0011]本专利技术还提供一种检测样本中甲苯噻嗪的试剂盒，所述试剂盒包括所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体。
[0012]进一步地，所述样本为尿液。
[0013]本专利技术所述的抗甲苯噻嗪单克隆抗体在甲苯噻嗪免疫检测中的应用。
[0014]有益效果：本专利技术运用甲苯噻嗪
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BSA偶联物免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的杂交瘤细胞，通过培养和再免疫获得大量小鼠腹水，再经多步分离及纯化获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗甲苯噻嗪的单克隆抗体anti
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xylazine
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mab1，为开发检测甲苯噻嗪的免疫测试产品提供了所需的原料；本专利技术的抗甲苯噻嗪单克隆抗体anti
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xylazine
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mab1可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。
具体实施方式
[0015]实施例1：抗原甲苯噻嗪
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BSA偶联物制备
[0016]1.在室温条件下，100mg甲苯噻嗪溶解于5ml吡啶中，剧烈搅拌下，加入55mg的丁二酸酐，常温反应过夜。后处理：用旋转蒸发仪在45℃将吡啶蒸去，再加入5ml二氯甲烷和3ml水，萃取出有机相中的丁二酸酐，有机相再用3ml饱和氯化钠萃取一次，再用无水硫酸钠干燥有机相。合并有机相后浓缩得到150mg粗产物。过柱纯化后得到产物xylazine 120mg。
[0017]2.将120mgxylazine溶解于2ml N,N
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二甲基甲酰胺中，再加入53.4mg N
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羟基琥珀酰亚胺和88.5mg N
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乙基
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N
’‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺，在转速为15转/分钟的转盘上反应24小时。得到活化后的xylazine。
[0018]3.配置24ml 10mg/ml的BSA
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PBS溶液(BSA的含量：10mg/ml，pH：7.4)，再将活化后的xylazine溶液在冰水浴的条件下缓慢加入到BSA
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PBS溶液中，再放置在转速为15转/分钟的转盘上偶联24小时。
[0019]4.偶联结束后，用1
×
PBS透析，每2小时换一次PBS。换7
‑
9次的PBS后，收样，得到甲苯噻嗪抗原8.5mg/ml，共26ml。
[0020]其中，甲苯噻嗪抗原合成过程如下所示：
[0021][0022]实施例2：酶联反应ELISA检测样本中的抗体效价
[0023](1)底板包被：将实施例1中制备的甲苯噻嗪抗原用包被稀释液(ph9.6的碳酸盐缓冲液,CB)稀释到3μg/ml，每孔各加入配好的包被液(ph9.6的碳酸盐缓冲液,CB)100μl，置4℃冰箱，放置24h。
[0024](2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液
(ph7.4的磷酸盐缓冲液,PBS)满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0025](3)封闭酶标反应孔：每孔加入200μl 5％小牛血清后置37℃封闭90min，封闭结束后用洗涤液(ph7.4的磷酸盐缓冲液,PBS)满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0026](4)加入待检测样品：将待测样本(比如血清、腹水、杂交瘤细胞体外培养时的上清液、纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体，所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列为SEQ ID NO:3～5；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列为SEQ IDNO:11～13。2.如权利要求1所述的抗甲苯噻嗪单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。3.一种抗甲苯噻嗪单克隆抗体，所述抗甲苯噻嗪单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，编码所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列为SEQ ID NO:6～8；所述轻链可变区的CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文涛，上官科科，成含锋，
申请(专利权)人：杭州旭科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：