一种代谢木糖的蛹虫草菌株及其高产虫草素的培养方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域。具体涉及一种能够高效率代谢木糖的蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Fr.）20200930147，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 2021415。本发明专利技术公开一种蛹虫草菌株20200930147以木糖为碳源，结合氨基酸、其他氮源和甜菜碱的优化组合为培养基，通过液体静置培养获得高产量虫草素的方法。本发明专利技术菌株在这种培养方法下，在25℃培养25天的优选条件下，可以合成5.30 g/L虫草素。本发明专利技术利用蛹虫草实现了虫草素的低成本、高效率生产制备，生产所得的虫草素在医药保健、功能食品和化妆品领域具有重要的应用价值和广阔的市场前景。具有重要的应用价值和广阔的市场前景。具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种代谢木糖的蛹虫草菌株及其高产虫草素的培养方法


[0001][0002]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种能够高效率代谢木糖的蛹虫草菌株及其高水平合成虫草素的培养方法。

技术介绍

[0003]蛹虫草（Cordyceps militaris （L.）Fr.）又称北虫草，分类学上属于子囊菌亚门（Asomycotina）、麦角菌科（Claviticpitaceae）、虫草属（Cordyceps）真菌，是我国著名的中药材之一。蛹虫草通过人工栽培或菌丝体发酵，能够产生虫草素、虫草酸、多糖、麦角甾醇、γ
‑
氨基丁酸、维生素等多种生理活性物质，其中虫草素的合成水平远高于其他虫草类或丝状真菌。虫草素（Cordycepin）又称3'
‑
脱氧腺苷（3
‑
deoxyadenosine），由腺苷和脱氧戊糖组成，分子式为C
10
H
13
N5O3，为第一个从真菌中获得的核苷类抗生素。除了具备抗细菌和抗病毒活性，虫草素已被证实具有抑制 mRNA 聚腺苷酸化，调节各种细胞过程，抗癌、抗炎、改善皮肤老化等药理作用，使其在生物医药、功能食品、保健品和化妆品等领域具有重要的应用价值。虫草素的化学合成具有工艺复杂、效率低和成本高的缺点。利用蛹虫草优良菌株生物合成虫草素是实现这种药物分子规模化制备的重要途径。
[0004]蛹虫草发酵合成虫草素的水平受菌株类型、培养基营养成分、培养方式等各种因素的影响。自然界中，木糖以大分子木聚糖的形式存在，为仅次于葡萄糖（纤维素成分）第二丰富的糖。通过生物技术将木糖转化为高附加值的产品具有重大意义。有研究表明，木糖是蛹虫草合成虫草素的理想碳源，但已报道的蛹虫草菌株对木糖的利用水平低，导致发酵合成虫草素总量不高。Wongsa等（2020）报道，蛹虫草菌株TBRC7358能够利用6 g/L的木糖，形成的生物量是以葡萄糖为碳源培养获得生物量的41.7%，单位生物量合成的虫草素水平为葡萄糖发酵的2倍。培养基的其他营养成分如氮源类型和氨基酸的添加等也对蛹虫草合成虫草素具有显著影响。同时，相对于固态发酵和液体振荡发酵，液体静置发酵法更有利于蛹虫草高水平合成虫草素。综合考虑菌株、营养源和发酵方式等多种因素，可能实现虫草素发酵水平的进一步提升。目前，已报道的能够高水平合成虫草素的蛹虫草菌株资源仍然不足，筛选获得优良的蛹虫草菌株资源并建立高效的虫草素发酵培养方法符合日益增长的虫草素市场需求。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对目前市场上高产虫草素蛹虫草菌株资源不足的现状，本专利技术目的在于提供一种能够高效代谢木糖的蛹虫草菌株20200930147。本专利技术的另一目的是提供上述蛹虫草菌株20200930147高水平合成虫草素的培养方法，以实现虫草素的低成本和高效率制备。
[0006]技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：提供一种蛹虫草菌株20200930147，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为
2021年4月19日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，保藏号为CCTCC No：M 2021415。
[0007]其中，上述蛹虫草菌株20200930147内转录间隔区ITS (Internal Transcribed Spacer) 序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]其中，上述蛹虫草菌株的生长温度范围为4℃~32℃。
[0009]其中，上述蛹虫草菌株的最适生长温度为23℃~25℃。
[0010]其中，上述蛹虫草菌株可利用碳源包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖和乳糖。
[0011]其中，上述蛹虫草菌株在液体静置培养下利用木糖的量达到60 g/L。
[0012]上述的蛹虫草菌株高产虫草素的培养方法，包括以下步骤：1）取蛹虫草菌株20200930147转接于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基，25℃避光培养5 d，培养制得斜面母种；2）取蛹虫草的菌丝培养物5~6块接种于沙氏Ⅱ培养基，培养基装量为20%~50%，并放入8~12颗直径4 mm玻璃珠，28℃、200 r/mim下振荡培养4 d得到种子液；3）取5 mL种子液接入装有100 mL液体发酵培养基的250
‑
mL的三角瓶中，并置于25 ℃培养箱中静置培养25 d，发酵过程中避免搅动菌丝；4）发酵结束后，用尼龙布过滤分离培养液与菌丝体，将培养液转入新的离心管中，高效液相色谱法（HPLC）法测定其中虫草素含量；菌丝体洗去表面残留培养基，烘干测定其干重。发酵上清置于4 ℃冰箱避光保存，菌丝置于干燥器中保存。
[0013]其中，上述PDA培养基按配比成分的重量比例计包括：20%去皮马铃薯、2%葡萄糖、2%琼脂、pH自然。
[0014]其中，上述沙氏Ⅱ培养基按配比成分的重量比例计包括：0.5%麦芽糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏、0.1% K2HPO4、0.1% KCl、0.1% MgSO4·
7H2O、pH 6.0。
[0015]其中，上述液体发酵培养基按配比成分的重量比例计包括：4%木糖、1%蛋白胨、0.5%酵母浸出粉、0.2%腺苷、0.2%精氨酸、0.25%尿素、0.1%K2HPO4、0.1% KCl、0.1% MgSO4·
7H2O、pH6。培养基用纱布封口，再包一层锡箔纸，115℃灭菌30 min。木糖配制成20%的母液，单独115℃灭菌30 min，使用前按比例加入培养基中。
[0016]其中，上述发酵液中虫草素含量的HPLC测定方法为：取1 mL发酵液以10,000 r/min离心20 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品中的虫草素含量，分析柱为C18反相柱（100 mm
×
4.6 mm），流动相为15%甲醇和85%水，柱温30℃，流速1 mL/min，检测波长为260 nm。
[0017]其中，上述发酵液中虫草素含量可达5.30 g/L。
[0018]用于扩增所述的蛹虫草菌株ITS基因序列的特异性引物，包括以下两条序列：上游引物：5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3′
；下游引物：5
′‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3′
。
[0019]有益效果：本专利技术具有以下优点：本专利技术分离到一种新的蛹虫草菌株，该菌株能够正常代谢木糖积累生物量，该菌株在优化的含木糖培养基中以液体表面培养方式能够高水平合成虫草素。本专利技术实现了低成本和高效率制备虫草素，对促进虫草素的规模化生产具有重要价值。
附图说明
[0020]图1是蛹虫草菌株20200930147的野生子实体形态图图2是基于ITS序列构建的蛹虫草20200930147和相关真菌的系统进化树图3是蛹虫草菌株202009301本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛹虫草菌株20200930147，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年4月19日，保藏号为CCTCC No：M 2021415，可用于虫草素的高产培养。2.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株内转录间隔区（ITS）序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株，其特征在于，所述蛹虫草菌株的生长温度为4℃~32℃。4.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株，其特征在于，所述蛹虫草菌株的最适生长温度为23℃~25℃。5.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株，其特征在于，所述蛹虫草菌株能够在以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖为单一碳源的培养基中生长。6.根据权利要求1所述的蛹虫草菌株，其特征在于，所述蛹虫草菌株在液体静置培养条件下利用木糖的量达到60 g/L。7.一种根据权利要求1所述的蛹虫草菌株高产虫草素的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取蛹虫草菌株保藏种转接于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基，4℃~32℃下避光培养，优选温度为25℃，避光培养5 d ~14 d，培养制得斜面母种；2）取蛹虫草菌株斜面母种的菌块5~6块接种于沙氏Ⅱ培养基，培养基装量为20%~50%，并放入8~12颗直径4 mm玻璃珠，28℃、200 r/mim下振荡培养4 d得到菌悬液；3）取菌悬液按3%~1...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙良鲲，林群英，刘真，
申请(专利权)人：中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，
类型：发明
国别省市：