一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的引物和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的引物和试剂盒及其应用，属于病原体核酸检测领域领域。本发明专利技术利用八连排冻干技术将检测试剂固定冻干在八连排PCR管中，每孔共利用4个通道检测4种靶标，八连排8个孔检测不同靶标，共覆盖31个靶点及1个内标基因。另外针对普通的荧光PCR法操作复杂的问题，本方法可做到尿液样本粗提直扩，无需专门的细菌/真菌核酸提取试剂盒进行核酸提取，最大限度的减少了人员操作步骤，大大降低本方法的使用门槛，利于方法的广泛应用。利于方法的广泛应用。利于方法的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的引物和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于病原体核酸检测
，具体涉及一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]尿路感染(Urinary tract infection，UTI)是全球范围内的常见高发病，发病率在感染性疾病中仅次于呼吸道疾病位居第二。
[0003]引起尿路感染的常见病原体包含革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌，例如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形菌、柠檬酸杆菌、葡萄球菌、肠球菌、无乳链球菌、白色假丝酵母等均为临床上常见的尿路感染病原体。尿路感染病原体的诊断金标准为尿液细菌培养鉴定及药敏分析，但培养法的周期较长，通常要3
‑
5天时间，且漏检率高，灵敏度不佳。由于培养法从发病到出报告时长过长，因此目前尿路感染的诊治主要是通过临床症状评估结合经验性治疗来完成的，也就是根据患者的感染部位、发病情况、发病场所、既往抗菌药物用药史及其治疗反应等推测可能的病原体，同时结合当地细菌耐药性监测数据，先给予抗菌药物经验性治疗，待获知病原学检测及药敏试验结果后，再结合先前的治疗反应调整用药方案。这种经验推测性治疗方案一定程度上导致了抗生素的不合理使用，导致了细菌变异事态愈发严峻，继而使得耐药菌大幅增加和散播。
[0004]随着核酸检测技术的发展成熟，出现了越来越多针对尿路感染病原体的核酸检测技术，依靠核酸检测技术可在几小时内得到病原体及耐药基因的诊断结果，可弥补传统培养法的不足。例如，中国专利申请：CN202111625162.0公开了一种快速、简易、低成本筛查尿路感染病原菌的试剂盒及其应用荧光PCR法检测6种尿路感染病原菌，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、奇异变形杆菌。荧光PCR法为现阶段核酸检测技术中最为成熟、市场占有率最高的技术手段，由于其灵敏度高特异性好成本可控的特点，在病原体检测领域应用广泛。但该专利中基于荧光PCR法公开的方法仅能检测6种病原体，覆盖面较窄，易造成其他重要病原体漏检，且不包含耐药基因的检测，无法准确指导用药，应用有限。另外该专利中报道的方法使用操作时难度较大，需经过细菌核酸提取试剂盒提取步骤及PCR配液等过程，对人员场地要求较高。
[0005]中国专利申请CN202210409161.0公开了一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用；申请号为CN201110276409.2的中国专利技术专利公开了一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用；申请号为CN201610318778.6的中国专利技术专利公开了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法；申请号为CN201810537119.0的中国专利技术专利公开了一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。以上几种技术均以PCR扩增技术为基础，通过测序、基因芯片及量子点检测技术将PCR扩增产物进行分析检测，可达到同时检测多种病原体及耐药基因的目的。但同样有着成本高，操作繁琐，对人员场地要求高的问题。尤其PCR扩增后需用扩增产物进行下一步基因芯片杂交/量子点检测，
容易导致PCR产物气溶胶污染，造成假阳性结果，对操作者及操作环境要求高，增加了这些方法的推广难度。
[0006]因此，亟需一款快速、准确、便捷、操作简单、成本低廉的尿路感染病原体核酸检测产品，检测项目应可覆盖大多数常见病原体及耐药基因，可在疾病早期指导精准用药，解决临床诊疗痛点。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术需要解决的技术问题是提供一种可以同时检测多种尿路感染病原体及其耐药基因的引物，以解决现有技术中尿路感染病原体核酸检测量小、检测成本高、操作繁琐的问题。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述检测尿路感染病原体及耐药基因的引物在检测尿路感染病原体及耐药基因中的应用。
[0009]本专利技术最后要解决的技术问题是提供一种检测尿路感染病原体的的试剂盒。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的引物，包括如下引物组：
[0012]第一组引物：
[0013]检测金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌的特异性引物探针，序列如下：
[0014]引物SA
‑
F:5
’–
CAAAGAACTGATAAATATGGACGTGG
‑3’
；
[0015]引物SA
‑
R:5
’‑
TTTAGCCAAGCCTTGACGAACTA
‑3’
；
[0016]探针SA
‑
P:5
’‑
FAM
‑
TATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGC
‑
BHQ1
‑3’
；
[0017]引物SM
‑
F:5
’‑
CGCAGCCGCTCTGTTTC
‑3’
；
[0018]引物SM
‑
R:5
’
CCCAGCTACCTGCTGCAAG
‑3’
；
[0019]探针SM
‑
P:5
’‑
VIC
‑
TCGTGTGCAGATCCACCGGATGT
‑
BHQ1
‑3’
；
[0020]引物SS
‑
F:5
’‑
TTGCCAAGATACGCCAAATG
‑3’
；
[0021]引物SS
‑
R:5
’‑
CAAGGTGAAATTGATGACTATTGGG
‑3’
；
[0022]探针SS
‑
P:5
’‑
ROX
‑
AACCAGCCACATTGTTCTGCTTCAGG
‑
BHQ2
‑3’
；
[0023]引物GBS
‑
F:5
’‑
CATAATCTGTTCCCTGAACA
‑3’
；
[0024]引物GBS
‑
R:5
’‑
AAGTGACAACTCCACAAGTG
‑3’
；
[0025]探针GBS
‑
P:5
’‑
CY5
‑
TGAGCCATTTGCTGGGCTTG
‑
BHQ3
‑3’
；
[0026]第二组引物：
[0027]检测粪肠球菌、屎肠球菌、白色假丝酵母、脆弱拟杆菌的特异性引物探针，序列如下：
[0028]引物EFS
‑
F:5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测尿路感染病原体及耐药基因的引物，其特征在于，包括如下引物组：第一组引物：检测金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌的特异性引物探针，序列如下：引物SA
‑
F:5
’‑
CAAAGAACTGATAAATATGGACGTGG
‑3’
；引物SA
‑
R:5
’‑
TTTAGCCAAGCCTTGACGAACTA
‑3’
；探针SA
‑
P:5
’‑
FAM
‑
TATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGC
‑
BHQ1
‑3’
；引物SM
‑
F:5
’‑
CGCAGCCGCTCTGTTTC
‑3’
；引物SM
‑
R:5
’‑
CCCAGCTACCTGCTGCAAG
‑3’
；探针SM
‑
P:5
’‑
VIC
‑
TCGTGTGCAGATCCACCGGATGT
‑
BHQ1
‑3’
；引物SS
‑
F:5
’‑
TTGCCAAGATACGCCAAATG
‑3’
；引物SS
‑
R:5
’‑
CAAGGTGAAATTGATGACTATTGGG
‑3’
；探针SS
‑
P:5
’‑
ROX
‑
AACCAGCCACATTGTTCTGCTTCAGG
‑
BHQ2
‑3’
；引物GBS
‑
F:5
’‑
CATAATCTGTTCCCTGAACA
‑3’
；引物GBS
‑
R:5
’‑
AAGTGACAACTCCACAAGTG
‑3’
；探针GBS
‑
P:5
’‑
CY5
‑
TGAGCCATTTGCTGGGCTTG
‑
BHQ3
‑3’
；第二组引物：检测粪肠球菌、屎肠球菌、白色假丝酵母、脆弱拟杆菌的特异性引物探针，序列如下：引物EFS
‑
F:5
’‑
CGGAAATTAGTTCACAAACCATTT
‑3’
；引物EFS
‑
R:5
’‑
GCTTTCTGTGCTCTCGCTCTG
‑3’
；探针EFS
‑
P:5
’‑
FAM
‑
ATTCTTGGAAGCCTCGATAACCTA
‑
BHQ1
‑3’
；引物EFM
‑
F:5
’‑
GAAGATGGAACGATCCAAGGC
‑3’
；引物EFM
‑
R:5
’‑
GGCACACCAGCAGCTTGTAA
‑3’
；探针EFM
‑
P:5
’‑
VIC
‑
CCTTATGTCGGCGCAGGCG
‑
MGB
‑3’
；引物CA
‑
F:5
’‑
AAATCGAAGTGGATGGCAGG
‑3’
；引物CA
‑
R:5
’‑
GAGTACACCAATAAGAACCCTTTAC
‑3’
；探针CA
‑
P:5
’‑
ROX
‑
AGCAGGGGTGGCACAATTCACAG
‑
BHQ2
‑3’
；引物BF
‑
F:5
’‑
CTCGATAAGGTAAAAGCCAAGTTC
‑3’
；引物BF
‑
R:5
’‑
CAGTTCGGTTCCGCCATAG
‑3’
；探针BF
‑
P:5
’‑
CY5
‑
CGCTACGTCGTGCCCGGACAT
‑
BHQ3
‑3’
；第三组引物：检测大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、催产克雷伯菌、产气克雷伯菌的特异性引物探针，序列如下：引物EC
‑
F:5
’‑
TAAAATGGTTGCGGTGGTGA
‑3’
；引物EC
‑
R:5
’‑
CAAAGGCGTCAGCATCGG
‑3’
；探针EC
‑
P:5
’‑
FAM
‑
AACGCTTATGGTCACGGTCTTCTTG
‑
BHQ1
‑3’
；引物K
‑
F:5
’‑
GCCATCYTTGCTGTCATARTCG
‑3’
；引物KP
‑
R:5
’‑
TGATGGGCTTTGTGGCTTCA
‑3’
；探针KP
‑
P:5
’‑
VIC
‑
TGGCTTTGATCTTGCCGTACACATC
‑
BHQ1
‑3’
；
引物KO
‑
R:5
’‑
GATGATGGGTCTTATTGCTTCTTC
‑3’
；探针KO
‑
P:5
’‑
ROX
‑
ATCGCTTTGACTTTGCCGTAGACG
‑
BHQ2
‑3’
；引物KA
‑
R:5
’‑
GTTGCTTCTTCGGCTTCACA
‑3’
；探针KA
‑
P:5
’‑
CY5
‑
TGGCYTTCACTTTGCCGTACACG
‑
BHQ3
‑3’
；第四组引物：检测鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌的特异性引物探针，序列如下：引物AB
‑
F:5
’‑
ACTCTTGCATTCGGCTTCG
‑3’
；引物AB
‑
R:5
’‑
CGTTCTAACCAAATGGCAGCAG
‑3’
；探针AB
‑
P:5
’‑
FAM
‑
CCAACTGCTTGCATTAAGTGA
‑
MGB
‑3’
；引物PM
‑
F:5
’‑
CACCACACTACTATTTCCTCGAATC
‑3’
；引物PM
‑
R:5
’‑
CGGGAAGAATATCCACYGTGAC
‑3’
；探针PM
‑
P:5
’‑
VIC
‑
AGGGCAACCATTAAAACTCGCTACA
‑
BHQ1
‑3’
；引物PA
‑
F:5
’‑
ATGCGGAAGCCATCATGTC
‑3’
；引物PA
‑
R:5
’‑
CAGGCATTGGTCGAGGAGA
‑3’
；探针PA
‑
P:5
’‑
ROX
‑
ATGACGAGTTGTTTGCCCCGCT
‑
BHQ2
‑3’
；引物ECC
‑
F:5
’‑
GGCAAAGCAAGACTATTACGAGA
‑3’
；引物ECC
‑
R:5
’‑
GCGCTTRTATGCCTTTTTGATT
‑3’
；探针ECC
‑
P:5
’‑
CY5
‑
TTTAGGCGTTCCGAAAACTGCG
‑
MGB
‑3’
；第五组引物：检测摩氏摩根菌、表皮葡萄球菌、柠檬酸杆菌、内标基因的特异性引物探针，序列如下：引物MM
‑
F:5
’‑
TTTGGTATGGTGAATTTCCATTGTC
‑3’
；引物MM
‑
R:5
’‑
TGAGCGGTTCGGTCAATTACT
‑3’
；探针MM
‑
P:5
’‑
FAM
‑
TCGAAATGCGGTTCTAACGCATCATAAGC
‑
BHQ1
‑3’
；引物SE
‑
F:5
’‑
CTCTCGCTTTTAGTAATGATAACCAATG
‑3’
；引物SE
‑
R:5
’‑
CACTTGTGACRCAAATCATTTGTTATG
‑3’
；探针SE
‑
P:5
’‑
VIC
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡禹希，李锦锦，冯云奎，周志图，
申请(专利权)人：无锡百泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：