基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法技术方案

本发明专利技术提供了基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法，系统组成包括：微液滴裂解与生成模块，用于实现液滴内单细胞染色抗体的掉落；微液滴石英压缩通道检测模块，用于实现微液滴中单细胞蛋白荧光信号的收集与检测；微液滴荧光信号收集与处理模块；用于对采集到的荧光信号的处理与分析；微液滴驱动模块，用于实现微液滴在微通道中的流速控制。本发明专利技术通过使用石英代替常见基底材料降低光学噪声，通过使用正弦波控制激光源对产生荧光进行调制，降低电噪声，与已有方法相比，其检测分辨率有两个数量级的显著提升；本发明专利技术通过优化细胞裂解液成分，与已有方法相比，实现了检测结果的高可靠性与准确性。现了检测结果的高可靠性与准确性。现了检测结果的高可靠性与准确性。

【技术实现步骤摘要】
基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法


[0001]本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法。

技术介绍

[0002]单细胞蛋白高分辨率定量检测是指在短时间内针对某些含量较少的蛋白实现大量单个细胞的某种或多种蛋白分子数的定量检测，这种蛋白定量分析结果为细胞异质性提供着关键参数，有助于肿瘤的机理研究和临床诊断治疗。
[0003]目前单细胞蛋白定量通常采用荧光流式细胞术或质谱流式细胞术，荧光流式细胞术其利用荧光标记抗体染色的细胞通过毛细管冲洗，荧光强度由光电倍增管量化。随后基于化学修饰后的校准珠，荧光流式细胞术可以对单细胞表面蛋白进行准确定量，但该方法由于缺乏相应胞内蛋白校准珠，无法准确定量单细胞胞内蛋白的分子数。质谱流式细胞术采用稀土金属标记抗体染色的细胞被电离并利用飞行时间质谱仪进行分析，从而量化单个细胞中的蛋白质表达。虽然该方法可以在单细胞水平上同时检测细胞内和细胞表面蛋白，但由于缺乏校准方法，其无法获得单细胞蛋白的准确分子个数。
[0004]由于微流控技术与生物细胞(几十到几百微米)之间的尺寸相匹配，它已经成为单细胞分析的一个重要工具。对于基于微流控技术的单细胞蛋白定量分析，主要有两种方法：微雕刻法和条码芯片法，二者原理主要是将单细胞限制在微孔或微腔中，然后进行细胞裂解、蛋白捕获及定量。尽管这些微流控方法是基于大阵列的分析，但它们不能连续地表征单个细胞，因此受到了吞吐量的限制，检测通量较低。
[0005]近年来，一种基于压缩通道的微流控平台，以高通量的方式定量单细胞的特异性胞内蛋白。在这种微流式细胞术法中，利用压缩的微通道作为校准结构，荧光标记抗体染色的细胞被迫挤压通过压缩通道，收集原始荧光信号。同时，已知浓度的荧光抗体溶液通过该压缩通道以产生校准曲线，从而能够将原始荧光信号转换为特异性胞内蛋白数。尽管基于这种方法，可以获得单细胞胞内蛋白数，但这种方法由于其细胞尺寸是比压缩通道截面尺寸小的，造成其经常发生堵塞的问题，从而影响检测效率。
[0006]最近考虑使用基于微液滴的方法，将细胞在液滴中裂解，用液滴代替细胞通过压缩通道，由于液滴相比细胞本身其无支撑结构，所以其可在压力作用下，顺利通过压缩通道而不会造成堵塞的问题。但现有的基于微液滴压缩通道定量检测单细胞蛋白的方法，受限于微液滴对于细胞的稀释作用和较大的背景噪声，导致其检测分辨率较低，很难成为研究肿瘤异质性的有效方法。
[0007]因此研发一种基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法，在解决细胞堵塞问题的同时实现方法分辨率的提升，从而实现更多蛋白种类的检测，对于进行肿瘤异质性的研究是具有非常重要的科学意义的。

技术实现思路

[0008](一)要解决的技术问题
[0009]研发一种基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统及方法，解决现有微液滴检测方法分辨率较低的问题，以实现满足含量更少蛋白检测的临床需求。
[0010](二)技术方案
[0011]为了解决上述问题，本专利技术一方面提供了一种基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统，所述系统包括：微液滴裂解与生成模块，包括免疫荧光染色细胞、细胞裂解液、以及氟化油和微液滴生成微通道，所述细胞裂解液用于实现液滴内单细胞免疫染色抗体的掉落，从而保证荧光在微液滴内均匀分布，通过控制两水相和油相的流速大小和流速比，实现稳定的单细胞微液滴包裹，在所述微液滴生成通道中生成均匀荧光分布的微液滴，所述的两水相为免疫荧光染色细胞和细胞裂解液，所述的油相为氟化油；微液滴石英压缩通道检测模块，包括石英压缩微通道、石英基底、铬窗、光电倍增管和正弦波控制的激光光源，(所述石英基底材料相比已有方法中的基底材料如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，简称PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate，简称PMMA，有着较小的自发荧光，代替已有方法中的PDMS材料作为替代的荧光检测基底，并由此做成石英压缩微通道进行荧光检测)，通过对进入所述石英压缩微通道中的包含单个待检测细胞中的微液滴蛋白进行荧光激发，所述光电倍增管用于将检测得到荧光信号转换成电压信号，再用正弦波控制的激光光源进行荧光调制，所述正弦波控制的激光光源将液滴中的单细胞蛋白荧光信号调制到高频实现低频电噪声的去除；微液滴荧光信号收集与处理模块，包括信号发生器、锁相放大器、数据采集卡和信号采集系统，其中，所述信号发生器用于提供锁相放大器所需的参考信号即调制激光光源的交流正弦波信号，对信号发生器调制后的移到高频的荧光电压信号，使用所述锁相放大器将所述的调制后的移到高频的荧光电压信号解调为低频电压信号，将所述低频电压信号输入到数据采集卡转换成数字信号，由信号采集系统进行数据处理和分析，结合蛋白分子数与电压信号关系曲线，确定单个待检测细胞中蛋白分子数。
[0012]其中，所述均匀荧光分布的微液滴为荧光标记蛋白染色的单细胞微液滴。
[0013]进一步地，所述锁相放大器用于对检测得到的荧光电压信号进行调制和解调消除检测中的电噪声；数据采集卡用于采集所述电压信号并传输给中央控制器，根据信号采集系统用荧光电压信号确定单个待检测细胞中蛋白分子个数。
[0014]可选地，所述系统还包括微液滴驱动模块，用于对进入所述石英压缩微通道的待测液滴进行流速控制，使得单个液滴能够匀速通过所述石英压缩微通道中的激发检测区，不会发生液滴破碎或者融合现象。
[0015]进一步地，微液滴裂解与生成模块主要由微液滴生成芯片组成。
[0016]微液滴生成芯片位于微液滴石英压缩通道检测模块的显微镜载物台上，首先通过微液滴生成芯片形成微液滴，然后微液滴包含裂解液与目标单细胞共孵育，实现荧光抗体在微液滴中的均匀分布。
[0017]进一步地，微液滴石英压缩通道检测模块包括微液滴石英压缩通道检测芯片。
[0018]进一步地，微液滴石英压缩通道检测芯片位于微液滴石英压缩通道检测模块的显微镜的载物台上，通过微液滴荧光信号收集与处理模块实现微液滴荧光信号的收集与处
理。
[0019]进一步地，所述微液滴生成芯片上设置有所述微液滴生成微通道。所述微液滴生成微通道为十字沟道；所述十字沟道具有彼此相反的第一端和第二端，以及彼此相反的第三端和第四端；十字沟道的第一端为免疫荧光染色细胞和细胞裂解液输入端；十字沟道的第二端为均匀荧光分布的微液滴流出端；十字沟道的第三端为氟化油输入端；十字沟道的第四端容纳有氟化油；在微液滴生成微通道内形成荧光标记蛋白染色的单细胞微液滴。免疫荧光染色细胞和细胞裂解液均为水相；氟化油为油相。通过进行细胞裂解液的优化，实现液滴内免疫染色抗体的掉落，从而保证荧光在微液滴内均匀分布，通过调节两水相和油相流速比和流速大小，实现稳定的单细胞微液滴包裹。
[0020]进一步地，所述微液滴驱动模块包括手动压力泵和微管，首先在微液滴石英压缩通道检测芯片键合一层已经打孔的聚二甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于微液滴压缩通道的单细胞蛋白高分辨率定量检测系统，其特征在于，所述系统包括：微液滴裂解与生成模块(1)，包括免疫荧光染色细胞(101)、细胞裂解液(102)、以及氟化油(103)和微液滴生成微通道；所述细胞裂解液(102)用于实现液滴内单细胞免疫染色抗体的掉落，从而保证荧光在微液滴内均匀分布，通过调节两水相和油相流速比和流速大小，实现稳定的单细胞微液滴包裹，在所述微液滴生成通道中生成均匀荧光分布的微液滴；所述的水相分别为免疫荧光染色细胞(101)和细胞裂解液(102)，所述的油相为氟化油(103)；优选地，微液滴驱动模块(2)，包括手动压力泵(201)和微管；手动压力泵通过微管与微液滴石英压缩通道的上通孔相连，在微通道中形成均匀压力，保证微液滴能够匀速通过石英压缩微通道而不是发生破碎或者融合；微液滴石英压缩通道检测模块(3)，包括石英压缩微通道(301)、石英基底(302)、铬窗(303)、光电倍增管(304)和正弦波控制的激光光源(305)；通过对进入所述石英压缩微通道(301)中的包含单个待检测细胞中的微液滴蛋白进行荧光激发，并用光电倍增管(304)接收荧光信号转成电压信号，再用正弦波控制的激光光源(305)进行荧光调制，所述正弦波控制的激光光源(305)将液滴中的单细胞蛋白荧光信号调制到高频实现低频电噪声的去除；微液滴荧光信号收集与处理模块(4)，包括信号发生器(401)、锁相放大器(402)、数据采集卡(403)和信号采集系统(404)，其中，所述信号发生器(401)用于调制所述激光光源(305)以产生交流正弦波信号作为参考信号输入到锁相放大器(402)的参考信号端，而调制后到高频的荧光电压信号输入到锁相放大器(402)的待测信号端，使用锁相放大器(402)解调并降噪为低频电压信号，将所述低频电压信号输入到数据采集卡(403)转换成数字信号，由信号采集系统(404)进行数据处理和分析，结合蛋白分子数与电压信号关系曲线，确定单个待检测细胞中蛋白分子数。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微液滴生成微通道为十字沟道；所述十字沟道具有彼此相反的第一端和第二端，以及彼此相反的第三端和第四端；十字沟道的第一端为免疫荧光染色细胞(101)和细胞裂解液(102)输入端；十字沟道的第二端为均匀荧光分布的微液滴流出端；十字沟道的第三端为氟化油(103)输入端；十字沟道的第四端容纳有氟化油(103)；优选地，所述的细胞裂解液(102)，包括蛋白酶K、盐酸胍和尿素；所述细胞裂解液(102)中，蛋白酶K浓度为1mg/mL、盐酸胍浓度为3mol/L和尿素浓度为3mol/L。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微液滴驱动模块(2)包括手动压力泵和微管，首先在微液滴石英压缩通道检测模块(3)键合一层已经打孔的聚二甲基硅氧烷材料，手动压力泵通过微管连接这层打孔的聚二甲基硅氧烷材料，控制微液滴在微液滴石英压缩通道检测模块(3)中的流速大小。4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微液滴裂解与生成模块(1)主要由微液滴生成芯片组成，微液滴生成微通道设置在微液滴生成芯片上；所述微液滴生成芯片的截面尺寸为20
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20um2；优选地，通过注射泵分别控制免疫荧光染色细胞(101)水相和...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健，杨光，卫元晨，杨泓宇，张婷，高驰远，王军波，陈德勇，
申请(专利权)人：中国科学院空天信息创新研究院，
类型：发明
国别省市：