一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。本发明专利技术创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。能力。

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]NK细胞是以CD3
‑
CD56+为标志的大颗粒淋巴细胞。作为免疫系统的重要组成部分，NK细胞在对抗病原体感染和肿瘤免疫监视中担任着哨兵和前线防御者的角色。与T、B细胞不同，NK细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。正常组织细胞由于高表达MHCⅠ类分子,可与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer
‑
cell immunoglobulin
‑
like receptor,KIR)家族抑制性受体结合，传递抑制信号，从而免受NK细胞攻击；而感染或转化的细胞通常下调表达MHCⅠ类分子，尽管可以因此逃避MHCⅠ限制性T细胞的识别，但可减弱MHCⅠ类分子和NK细胞抑制性受体结合传递的抑制信号，使NK细胞激活并杀伤感染或转化的细胞。由于利用NK细胞在对肿瘤的生物治疗中显示了巨大的应用潜力，人们一直在寻找最优的扩增活化NK细胞的方法。
[0003]NK细胞的冷冻保存也是制约NK细胞应用的重要步骤。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，且缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在不加保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，对细胞造成不可逆的永久损伤，甚至引起细胞死亡。
[0004]按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至
‑
70℃～
‑
80℃，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至
‑
100℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成，是目前细胞冻存最常用的一种方法。
[0005]现有的NK细胞冻存方法，复苏后存在细胞存活率降低、细胞活性低下等问题，NK细胞的临床应用需要能更好维持NK细胞活性的冻存方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种NK细胞冻存液，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。
[0009]本专利技术创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素
B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。
[0010]优选地，所述人血白蛋白在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6
‑
2％；例如0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0011]优选地，所述二甲基亚砜在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为5
‑
10％；例如5％、6％、7％、8％、9％、10％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0012]冻存液中二甲基亚砜含量较低，更适合于NK细胞冻存的临床应用。
[0013]优选地，所述右旋糖酐在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6
‑
1.5％；例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0014]优选地，所述聚乙二醇在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5
‑
6.0mg/mL；例如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、5.5mg/mL、6mg/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0015]优选地，所述维生素B12在所述NK细胞冻存液中的浓度为5
‑
50ng/mL；例如5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0016]在细胞冻存液中加入维生素B12，有助于提高细胞复苏后的存活率和杀伤靶细胞的能力。
[0017]当人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠以上述特定的浓度存在于冻存液中并进行配合时，具有更优的提高NK细胞复苏后的增殖和杀伤能力。
[0018]优选地，所述的NK细胞冻存液还包括木糖。
[0019]木糖的加入能够进一步提高细胞复苏后的增殖和杀伤能力，且木糖和维生素B12在上述效果上具有一定的协同作用。
[0020]优选的，所述木糖在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5
‑
3mg/mL。
[0021]优选地，所述右旋糖酐选自右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的任意一种或至少两种的组合。
[0022]第二方面，本专利技术提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液的制备方法，所述制备方法为：将各制备原料进行物理混合，即得。
[0023]第三方面，本专利技术提供一种根据第一方面所述的NK细胞冻存液在NK细胞冻存中的应用。
[0024]优选地，所述应用的具体步骤包括：将NK细胞与第一方面所述的NK细胞冻存液混合后，降温，冻存。
[0025]优选地，所述冻存液中NK细胞的密度为(1
×
106)
‑
(4
×
107)个/mL，例如1
×
106个/mL、2
×
106个/mL、3
×
106个/mL、4
×
106个/mL、5
×
106个/mL、6
×
106个/mL、7
×
106个/mL、8
×
106个/mL、9
×
106个/mL、1
×
107个/mL、2
×
107个/mL、3
×<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞冻存液，其特征在于，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。2.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6
‑
2％；优选地，所述二甲基亚砜在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为5
‑
10％；优选地，所述右旋糖酐在所述NK细胞冻存液中的质量百分含量为0.6
‑
1.5％。3.根据权利要求1或2所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述聚乙二醇在所述NK细胞冻存液中的浓度为0.5
‑
6.0mg/mL；优选地，所述维生素B12在所述NK细胞冻存液中的浓度为5
‑
50ng/mL。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述NK细胞冻存液还包括木糖。5.根据权利要求4所述的NK细胞冻存液，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冶陶，彭昉，俞英豪，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：