一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法技术

本发明专利技术涉及中药活性成分分离技术领域，特别涉及一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法。其中，所述方法基于Box

【技术实现步骤摘要】
一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法


[0001]本专利技术涉及中药活性成分分离
，特别涉及一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法。

技术介绍

[0002]畲药三叶青(Terastigma hemsleyamm Diels et Gilg)又名金线吊葫芦、蛇附子、石抱子，为葡萄科三叶崖爬藤属蔓生植物，是我国特有药用植物、福建特色畲药，主要以藤叶和地下块根入药，其性凉，味甘微苦，具有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效。现代药理研究表明，三叶青具有抗肝损伤、抗肿瘤、抗炎等作用，临床上主要用于治疗肺炎、乙型肝炎、急性支气管炎等疾病。三叶青化学成分丰富，主要含有黄酮、酚酸、三萜类等，其中三萜类化合物是三叶青重要的次生代谢产物，其具有降胆固醇、止咳、抗癌等显著药理活性。
[0003]现有技术存在三叶青中三萜化合物的相关报道，如刘东等从三叶青中分离鉴定蒲公英萜醇、蒲公英赛醇等；许阿娟等，采用UV
‑
Vis法测定三叶青药材中总三萜含量。现有充足的证据证明药材中的成分常包裹在植物细胞壁内，采用传统提取方法难以释放，提取率低，效率低(王云洁等，酶法在中药提取中的应用进展)。近年来，酶辅助提取法广泛应用于植物中黄酮、酚酸的提取工艺研究。纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等专属性酶可选择性破坏植物纤维素、细胞壁等致密结构，使得植物胞内成分更容易溶解、扩散，从而提高中药材中有效成分的溶出率。其中，酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量均对三叶青总三萜提取可能存在实质的影响，因此亟需一种基于酶辅助提取三叶青总三萜的优化方法。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于响应面法(Box
‑
Behnken)优化酶法辅助提取三叶青总三萜的方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，基于Box
‑
Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：
[0006]Y＝2.21
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6.500E
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003A
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0.058B
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8.333E
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003C
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0.071D+0.085AB
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0.018AC
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0.067AD
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0.042BC+0.075BD+0.044CD
‑
0.32A2‑
0.22B2‑
0.21C2‑
0.18D2；
[0007]其中，A为酶添加量，B为酶解pH，C为酶解时间，D为酶解温度，Y为总三萜提取率。
[0008]本专利技术的有益效果在于：本专利技术在单因素试验考察酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间的基础上，采用Box
‑
Behnken响应面法优化酶辅助的三叶青总三萜提取工艺。经过多项方程拟合，结果表面拟合方程显著，确定的酶辅助三叶青总三萜的最佳提取条件：以纤维素酶进行酶解，酶添加量为1.99％、酶解pH为4.82、酶解温度为42.56℃、酶解时间为88.62min。在此提取条件下，三叶青提取率的预测值为2.23％，经放大验证试验，三叶青总
三萜提取率为2.18％
±
0.07％，RSD为2.24，与模型接近。
附图说明
[0009]图1所示为酶种对三叶青总三萜提取率的柱状图；
[0010]图2所示为纤维素酶酶添加量(酶的用量)对总三萜提取率的折线图；
[0011]图3所示为纤维素酶酶解pH对总三萜提取率的折线图；
[0012]图4所示为纤维素酶酶解时间对总三萜提取率的折线图；
[0013]图5所示为纤维素酶酶解温度对总三萜提取率的折线图；
[0014]图6所示为三叶青总三萜提取率对酶添加量、酶解pH、酶解时间和酶解温度的响应面图示；
[0015]图7所示为在具体实施方式中Sebiferenic acid MS质谱图谱(ESI
‑
)。
具体实施方式
[0016]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0017]一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，基于Box
‑
Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：
[0018]Y＝2.21
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6.500E
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003A
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0.058B
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8.333E
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003C
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0.071D+0.085AB
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0.018AC
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0.067AD
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0.042BC+0.075BD+0.044CD
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0.32A2‑
0.22B2‑
0.21C2‑
0.18D2；
[0019]其中，A为酶添加量，B为酶解pH，C为酶解时间，D为酶解温度，Y为总三萜提取率。
[0020]其中，Sebiferenic acid(2α,3β
‑
dihydoxytarxer
‑
14
‑
en
‑
28
‑
oic acid，结构如式A所示)在三叶青内已被专利技术人首次提取得到。
[0021][0022]具体的，在三叶青内提取以及确定Sebiferenic acid的方法如下：将室温干燥48h的三叶青块根(3.2kg)，粉碎过40目筛，用甲醇浸提3天，之后进行减压浓缩，得到棕色粗提物(300g)，将粗提物用粒径为200～300nm的柱层层析硅胶填料(厂家：青岛海洋化工有限公司，批号：0120308)进行真空液相色谱分离，柱压为
‑
0.6Mpa，用环己烷/二氯甲烷50：1，等份收集，每份约250mL,共35份；二氯甲烷/乙酸乙酯10：1，等份收集，每份约250mL,共45份；乙酸乙酯/甲醇5：1，等份收集，每份约250mL,共30份，进行梯度洗脱。共收集110个亚组分。将亚组分样品以薄层分析重组(硅胶GF
254
板，展开剂为二氯甲烷/乙酸乙酯1：2)，15％硫酸乙醇进行显色，若样品斑点Rf值及色泽一致则合并为一组。在F40
‑
49组分中，薄层板斑点呈紫
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，其特征在于，基于Box
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Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：Y＝2.21
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6.500E
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003A
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0.058B
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8.333E
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003C
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0.071D+0.085AB
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0.018AC
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0.067AD
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0.042BC+0.075BD+0.044CD
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0.32A2‑
0.22B2‑
0.21C2‑
0.18D2；其中，A为酶添加量，B为酶解pH，C为酶解时间，D为酶解温度，Y为总三萜提取率。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述总三萜提取率以Sebiferenic acid提取率所确定，Sebiferenic acid质量浓度C对544nm吸收波长下的吸光度A的线性回归方程为：A＝0.0461C+0.0391。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述线性回归方程按如下方法获得：S1、获得以甲醇溶解、浓度为0.224mg/mL Sebiferenic acid对照品溶液；S2、精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL置于试管内，水浴挥干后分别加入0.2mL 5％香草醛
‑
冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，60℃水浴加热15min后冰浴冷却4min，向每管中加入5.0mL冰醋酸混匀，获得对照品；S3、0.2mL 5％香草醛
‑
冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液混合，并以冰醋酸补足至与所述对照品等体积，获得空白对照；S4、将对照品和空白对照在544nm最大吸收波长下测定吸光度值，重复三次取平均，绘制以吸光度A为纵坐标，Sebiferenic acid质量浓度为横坐标的标准曲线，得到所述线性回归方程。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：范世明，许文，徐惠龙，林瑶，卢明菲，杨楠，叶淼，徐伟，
申请(专利权)人：福建中医药大学，
类型：发明
国别省市：