双门孔道蛋白、孔道蛋白突变体、核苷酸序列及其应用制造技术

本申请提供一种双门孔道蛋白、孔道蛋白突变体、核苷酸序列及其应用，属于纳米孔单分子检测技术领域。双门孔道蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。孔道蛋白突变体，孔道蛋白突变体的氨基酸序列为：SEQ IDNO.2所示序列、第一突变体序列或第二突变体序列。第一突变体序列和第二突变体序列分别为与SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2同源性大于等于75％的序列。本申请的双门孔道蛋白和孔道蛋白突变体有利于提高待测物质的检测准确性、孔道蛋白的集成组装效果，也有利于有效对连续同一碱基序列进行检测，具有较佳的结构稳定性和电生理稳定性，也有利于促进跨孔道蛋白的待测物质待测物的有效捕获和/或易位。效捕获和/或易位。效捕获和/或易位。

【技术实现步骤摘要】
双门孔道蛋白、孔道蛋白突变体、核苷酸序列及其应用


[0001]本申请涉及纳米孔单分子检测
，具体而言，涉及一种双门孔道蛋白、孔道蛋白突变体、核苷酸序列及其应用。

技术介绍

[0002]纳米孔单分子检测技术是在电生理基础之上发展起来的新型检测方法。该方法的基本原理是：待测物质(核苷酸、蛋白以及多肽等)输运通过一个薄而小的纳米孔所产生的离子限域流。由于待测物质的理化性质存在差异，导致其在纳米孔内停留时对纳米孔电流的阻塞效应具有区分度；因此，通过对阻塞电流的分辨，可以得到待测物质的相关理化信息。这一方法具有非标记、高通量、成本低廉以及样本需求量小等优点，因此在目前基因测序和物质结构分析的不同手段中，纳米孔单分子检测技术具有广阔的前景。
[0003]生物纳米孔(即孔道蛋白)，由于其具有高灵敏度以及高重复性等特点，已经成为纳米孔单分子检测技术中最主要的焦点；将生物纳米孔镶嵌在磷脂双分子层中组装成生物芯片，借助计算机处理器和传感设备，以实现对待测物质的电信号和/或光信号的检测。
[0004]目前已有研究表明，α
‑
溶血素(α
‑
HL)、耻垢分枝杆菌毒素蛋白A(MspA)、气单胞菌溶素(aerolysin)、噬菌体phi29连接器马达蛋白(phi29connector)、外膜蛋白(OmpG)以及促胰液素纳米孔(GspD、InvG)、细菌淀粉样纤维(β
‑
amyloids)分泌通道结构(CsgG、CsgG
‑
CsgF、CsgG
‑<br/>CsgE)等不同蛋白纳米孔，能够进行核酸、多肽、蛋白、金属离子、抗生素、有机污染物的检测以及金属离子的价态和物质构型构向等变化分析。但是，现有的生物纳米孔对连续同一碱基序列检测准确率低、对电性差异的物质区分度低、孔道蛋白的结构稳定性差(例如，碱基序列测序中发生孔道蛋白的解聚)、电生理不稳定(孔道蛋白在开孔与关孔之间切换)或孔道蛋白的集成组装效果(生物纳米孔与磷脂双分子层组装形成的生物芯片的稳定性)差。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种双门孔道蛋白、孔道蛋白突变体、核苷酸序列及其应用，其旨改善现有的生物纳米孔在核酸测序中连续同一碱基序列检测准确率低、对电性差异的物质检测效果不佳、孔道蛋白的结构和单通道电生理不稳定以及孔道蛋白的集成组装效果不佳的技术问题。
[0006]第一方面，本申请提供一种双门孔道蛋白，双门孔道蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]在上述技术方案中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中具有中央门特征序列以及帽门特征序列，因而使得孔道蛋白为具有中央门和帽门结构的双门孔道蛋白；其中，帽门特征序列长达70个氨基酸，使得双门孔道蛋白具有更长的帽门结构；帽门收缩区至中央门收缩区的长度高达90埃，可减少帽门和中央门对待测物质的信号读取的干扰性，有利于提高双门孔道蛋白对待测物质的检测准确性；中央门的收缩区大小为4埃，可实现从单碱基上识
别核苷酸，进而有利于有效对连续同一碱基序列进行定序检测。此外，本申请提供的双门孔道蛋白中央门结构清晰，有较佳的结构稳定性，而单通道电流电压成线性关系，具有电生理稳定性，能够促进跨孔道蛋白的待测物质的有效捕获和/或易位，并具有较佳的集成组装效果(即双门孔道蛋白与磷脂双分子层组装成生物芯片的稳定性较佳)，因而在纳米孔单分子检测
中具有良好的应用前景。
[0008]可选地，双门孔道蛋白包括亚基多肽组成的多聚体，亚基多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]可选地，多聚体包括12
‑
16聚体。
[0010]多聚体包括12
‑
16聚体，即多聚体可包含12
‑
16个亚基多肽，可实现对双门孔道蛋白的孔径进行调控。
[0011]第二方面，本申请提供一种孔道蛋白突变体，孔道蛋白突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示的序列、第一突变体序列或第二突变体序列。
[0012]其中，第一突变体序列为与SEQ ID NO.1同源性大于等于30％的序列，第二突变体序列为与SEQ ID NO.2同源性大于等于30％的序列。
[0013]在上述技术方案中，由于SEQ ID NO.2所示的序列为SEQ ID NO.1所示的序列的截短体(其同样具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同的中央门特征序列以及帽门特征序列)，因而孔道蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示的序列时，也可实现提高待测物质的检测准确性以及孔道蛋白的集成组装效果，并可实现有效对连续同一碱基序列进行检测，且其孔道蛋白突变体也具有较佳的结构稳定性和较佳的电生理稳定性，也能够促进跨孔道蛋白的待测物质的有效捕获和/或易位；并且经过突变后可进一步优化孔道蛋白的功能。
[0014]由于第一突变体序列为与SEQ ID NO.1同源性大于等于30％的序列，第二突变体序列为与SEQ ID NO.2同源性大于等于30％的序列，第一突变体序列以及第二突变体序列有利于实现提高待测物质的检测准确性、孔道蛋白的集成组装效果，并可有利于实现有效对连续同一碱基序列进行检测，具有较佳的结构稳定性和较佳的电生理稳定性，也有利于促进跨孔道蛋白的待测物质的有效捕获和/或易位，以适用于不同情况的检测。
[0015]因此，本申请提供的孔道蛋白突变体也可用于分析物检测和分析，在纳米孔单分子检测
中具有良好的应用前景。
[0016]结合第二方面，本申请可选的实施方式中，孔道蛋白突变体包括亚基多肽组成的多聚体，多聚体为同源多聚体或异源多聚体。多聚体中的至少一个亚基多肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示的序列、SEQ ID NO.2所示的序列、第一突变体序列或第二突变体序列。
[0017]可选地，多聚体包括9
‑
20聚体。
[0018]多聚体包括9
‑
20聚体，即多聚体可包含9
‑
20个亚基多肽，可实现对孔道蛋白突变体的孔径进行调控。
[0019]结合第二方面，本申请可选的实施方式中，第一突变体序列满足以下A
‑
D条件中的至少一种：
[0020]A：SEQ ID NO.1所示的序列中至少一个氨基酸被替换。
[0021]B：SEQ ID NO.1所示的序列中插入至少一个氨基酸。
[0022]C：SEQ ID NO.1所示的序列中缺失至少一个氨基酸。
[0023]D：SEQ ID NO.1所示的序列中至少一个氨基酸被修饰。
[0024]或，第二突变体序列满足以下E
‑
H条件中的至少一种：
[0025]E：SEQ ID NO.2所示的序列中至少一个氨基酸被替换。
[0026]F：SEQ ID NO.2所示的序列中插入至少一个氨基酸。
[0027]G：SEQ ID NO.2所示的序列中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双门孔道蛋白，其特征在于，所述双门孔道蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；可选地，所述双门孔道蛋白包括亚基多肽组成的多聚体，所述亚基多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；可选地，所述多聚体包括12
‑
16聚体。2.一种孔道蛋白突变体，其特征在于，所述孔道蛋白突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2所示的序列、第一突变体序列或第二突变体序列；其中，所述第一突变体序列为与SEQ ID NO.1同源性大于等于30％的序列，所述第二突变体序列为与SEQ ID NO.2同源性大于等于30％的序列。3.根据权利要求2所述的孔道蛋白突变体，其特征在于，所述孔道蛋白突变体包括亚基多肽组成的多聚体，所述多聚体为同源多聚体或异源多聚体；所述多聚体中的至少一个亚基多肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示的序列、SEQ ID NO.2所示的序列、所述第一突变体序列或所述第二突变体序列；可选地，所述多聚体包括9
‑
20聚体。4.根据权利要求2所述的孔道蛋白突变体，其特征在于，所述第一突变体序列满足以下A
‑
D条件中的至少一种：A：SEQ ID NO.1所示的序列中至少一个氨基酸被替换；B：SEQ ID NO.1所示的序列中插入至少一个氨基酸；C：SEQ ID NO.1所示的序列中缺失至少一个氨基酸；D：SEQ ID NO.1所示的序列中至少一个氨基酸被修饰；或，所述第二突变体序列满足以下E
‑
H条件中的至少一种：E：SEQ ID NO.2所示的序列中至少一个氨基酸被替换；F：SEQ ID NO.2所示的序列中插入至少一个氨基酸；G：SEQ ID NO.2所示的序列中缺失至少一个氨基酸；H：SEQ ID NO.2所示的序列中至少一个氨基酸的侧链基团被修饰；其中，所述替换包括改变氨基酸的种类或改变氨基酸的构型；所述的改变氨基酸的种类包括：改变氨基酸的电性、改变氨基酸的疏水性、改变氨基酸的结构刚性或改变氨基酸的侧链基团大小；可选地，所述修饰包括糖基化修饰、磷酸化修饰、泛素化修饰、S
‑
亚硝基化修饰、N
‑
甲基化修饰、O
‑
甲基化修饰、N
‑
乙酰化修饰以及脂质化修饰中的至少一种；和/或，所述修饰包括：在所述侧链基团上添加卟啉、胆固醇以及十二烷基葡萄糖苷分子中的至少一种。5.根据权利要求4所述的孔道蛋白突变体，其特征在于，所述第一突变体序列满足以下条件：SEQ ID NO.1所示的序列中特定位点的氨基酸被替换电中性或带正电荷的氨基酸；其中，所述特定位点包括第85位点、第102位点、第158位点、第169位点以及第253位点中的至少一个。6.根据权利要求4所述的孔道蛋白突变体，其特征在于，所述第一突变体序列满足以下条件：SEQ ID NO.1所示的序列中第一区域的氨基酸和第二区域的氨基酸被分别替换为不同电性的氨基酸；其中，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘荣辉，傅暘，李毅，张阔，冯起顺，代馨，戴菁，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：