生产丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了生产丁酸的重组大肠杆菌的构建方法。本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及生产丁酸的重组微生物及其构建方法，向微生物中导入3

【技术实现步骤摘要】
生产丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及生产丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]丁酸(C4H8O2)是一种脂肪族短链脂肪酸，广泛应用于农业、工业、医药和食品等行业。如作为抗生素替代品添加于饲料；作为精细化工品原料，生产醋酸丁酸纤维素聚合物；作为医药前体，可以生产神经抑制剂γ
‑
氨基丁酸；作为原料生产香味物丁酸甲酯，用于食品行业。
[0003]丁酸梭菌是天然的生产丁酸菌，但其为严格厌氧菌，培养条件苛刻，遗传改造难，改造周期长。相对于丁酸梭菌，大肠杆菌的遗传背景清晰，操作技术成熟，改造大肠杆菌生产丁酸成为研究的热点。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的问题为如何提高微生物产丁酸能力。
[0005]为了解决以上问题，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌。
[0006]本专利技术提供的重组大肠杆菌，不含有乳酸脱氢酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酸激酶基因、甲酸乙酰转移酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因和富马酸还原酶基因；所述重组大肠杆菌含有3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶基因、酰基CoA转移酶基因、M1
‑
93启动子和RBSL1启动子。
[0007]所述3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶基因来源于丙酮丁酸梭菌和/或，所述巴豆酸酶基因来源于来源于丙酮丁酸梭菌；和/或，所述反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶来源于齿垢密螺旋体菌；和/或，所述M1
‑
93启动子来源于大肠杆菌。
[0008]所述重组大肠杆菌含有启动子P*
tesB
，P*
tesB
启动子为下述任一种DNA分子:1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1的DNA分子；2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
[0009]所述重组大肠杆菌含有酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒，所述酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒含有所述M1
‑
93启动子和所述M1
‑
93启动子驱动的所述酰基CoA转移酶基因。
[0010]所述重组大肠杆菌含有启动子RBSL1，RBSL1启动子为下述任一种DNA分子:1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列2的DNA分子；2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
[0011]所述重组大肠杆菌含有反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶Ter基因表达盒，所述反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶Ter基因表达盒含有所述RBSL1启动子和所述RBSL1启动子驱动的所述反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶基因。
[0012]所述重组大肠杆菌含有酰基硫脂酶TesB基因表达盒，所述酰基硫脂酶TesB基因表达盒含有所述P*
tesB
启动子和所述P*
tesB
启动子驱动的所述酰基硫脂酶基因。
[0013]上述重组大肠杆菌中，所述3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0014]A1)3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为CP030018(19日6月2018年)的第437865
‑
438713位的蛋白质3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶；
[0015]A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶活性的蛋白质，
[0016]A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶活性的融合蛋白质，
[0017]所述巴豆酸酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0018]B1)巴豆酸酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为AE001437(30日1月2014年)的第2835666
‑
2836451位的蛋白质巴豆酸酶，
[0019]B2)将B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有巴豆酸酶活性的蛋白质，
[0020]B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有巴豆酸酶活性的融合蛋白质，
[0021]所述酰基CoA转移酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0022]C1)酰基CoA转移酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第1569227
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1570411位的蛋白质酰基CoA转移酶，
[0023]C2)将C1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有酰基CoA转移酶活性的蛋白质，
[0024]C3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的具有酰基CoA转移酶活性的融合蛋白质；
[0025]所述乳酸脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0026]D1)乳酸脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2508048
‑
2509037位的蛋白质乳酸脱氢酶，
[0027]D2)将D1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质，
[0028]D3)在D1)或D2)的N端和/或C端连接标签得到的具有乳酸脱氢酶活性的融合蛋白质；
[0029]所述甲基乙二醛合酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0030]E1)甲基乙二醛合酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2883345
‑
2883803位的蛋白质甲基乙二醛合酶，
[0031]E2)将E1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有甲基乙二醛合酶活性的蛋白质，
[0032]E3)在E1)或E2)的N端和/或C端连接标签得到的具有甲基乙二醛合酶活性的融合蛋白质；
[0033]所述丙酸激酶基因编码下述任一种蛋白质：
[0034]F1)丙酸激酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第626900
‑
628108位的蛋白质丙酸激酶基因，
[0035]F2)将F1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有丙酸激酶基因活性的蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含有乳酸脱氢酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酸激酶基因、甲酸乙酰转移酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因和富马酸还原酶基因；所述重组大肠杆菌含有3
‑
羟基丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式
‑2‑
烯酰CoA还原酶基因、酰基CoA转移酶基因、M1
‑
93启动子和RBSL1启动子。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有启动子P*
tesB
，P*
tesB
启动子为下述任一种DNA分子:1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1；2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒，所述酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒含有所述M1
‑
93启动子和所述M1
‑
93启动子驱动的所述酰基CoA转移酶基因。4.根据权利要求1、2或3所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有酰基硫脂酶TesB基因表达盒，所述酰基硫脂酶TesB基因表达盒含有所述P*
tesB
启动子和所述P*
tesB
启动子驱动的所述酰基硫脂酶基因。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述3
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羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：A1)3
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羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为CP030018(19日6月2018年)的第437865
‑
438713位的蛋白质3
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羟基丁酰CoA脱氢酶；A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有3
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羟基丁酰CoA脱氢酶活性的蛋白质，A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有3
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羟基丁酰CoA脱氢酶活性的融合蛋白质，所述巴豆酸酶基因编码下述任一种蛋白质：B1)巴豆酸酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为AE001437(30日1月2014年)的第2835666
‑
2836451位的蛋白质巴豆酸酶，B2)将B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有巴豆酸酶活性的蛋白质，B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有巴豆酸酶活性的融合蛋白质，所述酰基CoA转移酶基因编码下述任一种蛋白质：C1)酰基CoA转移酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第1569227
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2836451位的蛋白质酰基CoA转移酶，C2)将C1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有酰基CoA转移酶活性的蛋白质，C3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的具有酰基CoA转移酶活性的融合蛋白质；所述乳酸脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：D1)乳酸脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2508048
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2509037位的蛋白质乳酸脱氢酶，D2)将D1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质，
D3)在D1)或D2)的N端和/或C端连接标签得到的具有乳酸脱氢酶活性的融合蛋白质；所述甲基乙二醛合酶基因编码下述任一种蛋白质：E1)甲基乙二醛合酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2883345
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2883803位的蛋白质甲基乙二醛合酶，E2)将E1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有甲基乙二醛合酶活性的蛋白质，E3)在E1)或E2)的N端和/或C端连接标签得到的具有甲基乙二醛合酶活性的融合蛋白质；所述丙酸激酶基因编码下述任一种蛋白质：F1)丙酸激酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第626900
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628108位的蛋白质丙酸激酶基因，F2)将F1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有丙酸激酶基因活性的蛋白质，F3)在F1)或F2)的N端和/或C端连接标签得到的具有丙酸激酶基因活性的融合蛋白质；所述甲酸乙酰转移酶基因编码下述任一种蛋白质：G1)甲酸乙酰转移酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为(27日1月2012年)的第62...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，樊飞宇，王金盛，姚蝶，徐洪涛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：