一株死亡谷芽孢杆菌SSB-10及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株死亡谷芽孢杆菌SSB

【技术实现步骤摘要】
一株死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10及其应用


[0001]本专利技术属于微生物和生物防治
，具体涉及一株死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10及其应用。

技术介绍

[0002]烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的土传性细菌病害。该病在我国烟田中发病率和致死率高，对烟草的产量和质量影响很大，造成了巨大的经济损失。由于环境安全问题的日益突出以及抗药性的不断显现，化学农药的使用受到越来越多的限制，因而对烟草青枯病的研究重点逐渐转移到生物防治上。微生物防治青枯病的作用机理主要是利用微生物之间的相互拮抗和竞争作用。自然界微生物种类繁多，为青枯病的生物防治提供了丰富的微生物资源。
[0003]目前，应用于烟草青枯病防治的微生物主要有内生菌和根际土壤微生物。常用的根际土壤微生物主要有芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌等，常用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。例如，杨欢在《烟草青枯病生防菌株的筛选、鉴定与应用评价》中公开了利用平板对峙试验筛选出一株解淀粉芽孢杆菌YH
‑
22，可有效在烟草的根部和茎部定殖，并在大田试验中，在烟草青枯病的高发期，表现出优于化学药剂的防效。Wang Anan等人在《Effect of K1,K2 Anti
‑
bacterial agents on tobacco Ralstonia solanacearum》(Engineering,2010,02(11):930
‑
934)中公开了筛选出了K1、K2两株菌，可在低浓度下显著抑制青枯雷尔氏菌的生长，并对菌体产生损伤，此外，也可有效降低幼龄烟草感染青枯病的机率。Liu Yanxia等人在《Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the application of antagonistic strains in combination with organic fertilizer》中公开了利用体外对峙试验，从烟草根部分离出了有效拮抗青枯雷尔氏菌的短短芽孢杆菌和娄彻氏链霉菌，在随后的盆栽试验和田间试验中，与有机肥混用，防效均可达至92.3％
‑
100.0％。中国专利CN111117936B中公开了从烤烟K326号烟株的根际土壤中筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，能够显著抑制青枯雷尔氏病原菌的生长，降低烟草青枯病的危害。但是，目前还未发现有关于死亡谷芽孢杆菌对青枯雷尔氏菌具有抑菌活性的相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术中从烟株根际土壤中分离出多种细菌，并通过抗青枯雷尔氏菌的拮抗实验筛选出了一株死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SSB
‑
10，将该菌株的发酵物兑水施用于烟株根部，结果表明其对烟草青枯病有较好的防治效果。
[0005]具体地，本专利技术是从湖北省恩施州宣恩县椒园镇水井坳村的种烟田块中采集根际土壤，采用稀释涂布的方法将土壤微生物悬浮液涂布于TSB培养基上进行细菌培养和分离，以青枯雷尔氏菌为靶标，通过平板试验进行筛选，得到对青枯雷尔氏菌具有显著抑菌活性的菌株SSB
‑
10，再经16S rDNA序列鉴定确定为死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。
该SSB
‑
10菌株已于2022年07月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20221063。
[0006]本专利技术中筛选死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10的方法包括以下步骤：
[0007]S1、细菌筛选
[0008]从湖北省恩施州宣恩县椒园镇水井坳村的种烟田块采集烟草根际土壤置于含若干个小玻璃珠的无菌容器中，配制成10wt％的土壤悬浮液，再用无菌水稀释该土壤悬浮液依次配制浓度梯度为10
‑2、10
‑3、10
‑4的土壤悬浮液；分别取10
‑2、10
‑3、10
‑4的土壤悬浮液涂布于TSB平板上于28℃下培养5d，挑取平板上的单菌落保存；TSB平板培养基的主要成分包含17.0g/L胰蛋白胨，3.0g/L大豆木瓜蛋白酶水解物，5.0g/L氯化钠，2.5g/L一水合葡萄糖，2.5g/L磷酸氢二钾，15g/L琼脂粉；
[0009]S2、青枯雷尔氏菌拮抗菌的筛选
[0010]将步骤S1中的单菌落点接至PDA平板中央，倒置放入28℃培养箱中培养3d；然后将培养至对数期的青枯雷尔氏菌喷雾至细菌长好的平板上，继续于28℃培养24h，挑选出对青枯雷尔氏菌具有显著抑菌活性的细菌；PDA平板培养基的主要成分含200g/L马铃薯，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉；
[0011]S3、细菌鉴定
[0012]将步骤S2中获得的对青枯雷尔氏菌具有显著抑菌活性的细菌进行液体培养，提取细菌的基因组DNA，以16S rDNA通用引物进行PCR扩增，对扩增后的DNA片段进行测序，得到细菌的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；将该16S rDNA序列在NCBI数据库中经Blast比对，并与Ezbiocloud数据库中匹配度较高的相关序列构建系统发育树，确定为死亡谷芽孢杆菌。液体培养的培养基主要成分含20g/L可溶性淀粉，1g/L硝酸钾，0.5g/L磷酸氢二钾，0.5g/L氯化钠，0.01g/L七水合硫酸亚铁，15g/L琼脂粉，pH为7.4。
[0013]本专利技术筛选的SSB
‑
10菌株产生的抑菌物质经温度适应性试验和酸碱稳定性试验证实，具有较强的环境温度适应性和酸碱稳定性，在
‑
20℃～115℃范围内处理不同时间均具有抑制青枯雷尔氏菌的活性，在pH＝1.0～14.0的范围内处理16h均具有抑制青枯雷尔氏菌的活性。这说明，在超出细菌生存条件的极限环境下，SSB
‑
10菌株的营养细胞虽然可能会死亡，但是其产生的抑菌物质仍然具有活性。
[0014]优选地，所述SSB
‑
10菌株产生的抑菌物质在50～100℃范围内处理60min具有显著的抑制青枯雷尔氏菌的活性；在pH＝3.0～9.0的范围内处理16h具有显著的抑制青枯雷尔氏菌的活性。
[0015]本专利技术筛选的SSB
‑
10菌株已成功用于防治烟草青枯病，具体方法如下：
[0016]将SSB
‑
10菌株进行发酵培养，将发酵培养物加水稀释配制成菌种浓度为1
×
108CFU/mL的菌液；在田间移栽烟苗时，对每株烟苗灌根200mL所述抑菌液。
[0017]优选地，SSB
‑
10菌株发酵培养的方法包括以下步骤：
[0018]取死亡谷芽孢杆菌SSB
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10，其特征在于，所述死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SSB
‑
10已于2022年07月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221063。2.根据权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10，其特征在于，所述死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10产生的抑菌物质在
‑
20℃～115℃或pH＝1.0～14.0条件下，均具有抗青枯雷尔氏菌的活性。3.一种含有权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10的微生物菌剂。4.权利要求1所述的死亡谷芽孢杆菌SSB
‑
10或权利要求2所述的微生物菌剂在防治青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述死亡谷芽孢杆菌SSB
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞，赵秀云，苑文芳，祁高富，施河丽，谭军，伍毓，沈始权，
申请(专利权)人：湖北省烟草公司恩施州公司，
类型：发明
国别省市：